薛元臻，芮 雯，王 慧

（1.Waters科技有限公司，廣東 廣州 510170；2.廣東藥學院中心實驗室，廣東 廣州 510006；3.首都師范大學生命科學學院，北京 100037）

nanoUPLC Q-TOF MS/MS在大鼠肝移植蛋白質組學研究中潛在生物標記物的應用

薛元臻1，芮 雯2，王 慧3

（1.Waters科技有限公司，廣東 廣州 510170；2.廣東藥學院中心實驗室，廣東 廣州 510006；3.首都師范大學生命科學學院，北京 100037）

建立應用納升級超高效液相色譜－質譜（nanoUPLC Q-TOF MS/MS）聯(lián)用技術研究大鼠同位肝移植術后不同時間差異表達蛋白質的蛋白質組學方法。建立10組大鼠肝移植動物模型后，隨機分成術后3天組（n＝5）和術后7天組（n＝5）。分別于術后3天和7天處死5只受體，取肝組織，提取總蛋白，Trypsin酶解后，使用Waters公司獨家專利MSeTM無標記定量技術，利用nanoUPLC-MS/MS技術對酶解后的肽段進行分析，數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質，采用生物信息學工具對所鑒定的蛋白質進行功能分類。7天組與3天組相比，兩樣品中同時存在的大部分蛋白上調(diào)，其中10個蛋白點表達水平明顯上調(diào)，比值變化在8.5倍以上。結合數(shù)據(jù)庫搜索得到鑒定，這些明顯上調(diào)的蛋白的分子功能主要與細胞骨架、離子結合、氧化應激反應、能量代謝等相關。

生物標記物；納升級超高效液相色譜；液相色譜－質譜聯(lián)用；肝移植；蛋白質組學

肝移植動物模型是探討移植后各種免疫反應發(fā)生機制不可缺少的手段。目前國際上涉及大鼠肝移植免疫反應的研究均采用近交系，有較多的排斥模型可供選擇，如DA→AUG、LEW→AUG、 DA→LEW、 LEW→Brown Norway等［1－3］。但國內(nèi)由于嚴重缺乏近交系大鼠，所以大多數(shù)仍用Wistar→SD或SD→Wistar建立急性排斥模型［4－5］。本課題組發(fā)現(xiàn)封閉群SD 和Wistar大鼠原位肝移植組合，出現(xiàn)了自然免疫耐受，表現(xiàn)為存活時間較文獻報道明顯延長［4－5］，難以滿足急性排斥反應或免疫耐受研究的需要。

基于質譜技術和生物信息學的蛋白質組學是后基因組時代興起的新型學科，是從整體水平對蛋白質的綜合分析，在了解疾病發(fā)生的機制、尋找疾病相關的“生物標記物”（biomarkers）等諸多領域中發(fā)揮重要的作用［6］。本實驗使用Waters公司獨家專利MSeTM無標記定量技術（Expression＠ Label Free Quantities），通過利用nanoUPLC-MS/MS技術觀察肝移植后不同時間蛋白質表達譜的變化，進一步驗證和探討大鼠肝移植模型 Wistar→SD出現(xiàn)自然免疫耐受的原因，為建立動物模型提供量化的指標，以及為發(fā)現(xiàn)潛在的生物標記物提供方向和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Waters nanoAcquity納升流速超高效液相色譜儀，Waters Synapt Q-TOF高分辨飛行時間質譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；過濾器：美國Millipore公司產(chǎn)品；超速離心機：美國Beckman公司產(chǎn)品。

碳酸氫銨、異硫氰酸胍（Guanidine）：美國Sigma公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇（DTT）：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；碘乙酸：美國Pierce Endogen公司產(chǎn)品；胰蛋白酶（Trypsin）：美國Promega公司產(chǎn)品；RIPA裂解液、BCA protein assay kit（蛋白定量試劑盒）：美國Biomed公司產(chǎn)品。

1.2 實驗設計與手術方案

本實驗所用大鼠購自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心，品系為雄性封閉群Sprague-Dawley（SD）和 Wistar大鼠，8～10周齡，體重200～250g，受體鼠體重略重于供體大鼠。飼養(yǎng)條件SPF級，受體鼠術前12h禁食，自由飲水，術后自由進食水。大鼠原位肝移植采用改良Kamada［7］雙袖套法。將10只Wistar大鼠作為供體，10只SD大鼠作為受體，術后隨機分成兩組。第一組：術后3天組；第二組：術后7天組。手術采用乙醚開放式麻醉，在無菌條件下進行。

1.3 樣品處理和蛋白的提取

分別于大鼠肝移植術后3天和7天處死大鼠，取肝組織后，迅速放入預冷PBS中漂洗，去除組織中的血液，用濾紙吸去多余的液體，加入RIPA 裂 解 液 （50mmol/L Tris pH 7.4，150 mmol/L NaCl；1%Triton X-100，1%sodium deoxycholate，0.1%SDS，sodium orthovanadate；sodium fluoride，EDTA等多種磷酸酶抑制劑），用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。充分裂解后取10～14kg離心3～5min，取部分上清用BCA方法測定蛋白濃度，其余上清分裝，于－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠肝移植后差異表達蛋白圖譜的建立

1.4.1 nanoUPLC條件 色譜柱：nanoAcquity 10cm BEH 柱100μm，10k；流動相 A：0.01%FA＋ Water；流 動 相 B：0.01%FA＋ACN；流速0.3μL/min；進樣體積1μL；柱溫35℃；梯 度 洗 脫 條 件 （B%/min）：2/0，50/60，80/61，2/62。

1.4.2 質譜條件 Waters Synapt HDMS QTOF，正離子模式運行，錐孔電壓25eV，碰撞電壓20～40eV，毛細管電壓3kV，霧化氣流速0.2L/h，源溫度100℃。

1.4.3 樣品前處理樣品按照Waters RapiGestTMSF Surfactant提供的胰蛋白酶Trypsin酶解實驗步驟，并根據(jù)實際情況做了一些修改。取約1mg總蛋白樣品放入離心管中，加入1mL 6mmol/L Guanidine溶液（配制在100mmol/L NH4HCO3中，pH 8.0），得到 1 g/L蛋白溶液。加入20mL 1mmol/L DTT到上述離心管中，震蕩混合5s，并在60℃條件下恒溫反應30min（以還原蛋白中的雙硫鍵）。加入25μL新鮮配制在1mmol/L NaOH中的Iodoacetic acid，避光、室溫條件下放置30min。將以上樣品平均注入2個（每個約注入500μL）具有分離10ku以下蛋白的Centricon filter，以12 000r/min離心50min。在以上離心管中分別加入200μL 0.1mmol/L NH4HCO3，并離心30min。多次重復此操作，以使蛋白樣品中的Guanidine含量降至0.5mmol/L左右。將以上2個離心管濾層上的蛋白樣品，分別、多次加入總量約500μL 0.1mmol/L NH4HCO3溶液以完全溶解，并將這些含有蛋白樣品的溶液轉移至裝有20μL的Trypsin試管中，再加入500μL 0.1mmol/L NH4HCO3溶液，使試管中液體的總量為1 000μL，Trypsin約占總量的1/50。將上述試管恒溫在37℃水浴中反應16h，分別吸取500μL上述樣品到2個Centricon filter中，以13 400r/min離心50min，這樣可以除去多余的Trypsin，終止酶切反應。將上述2個離心管下部的濾出液收集到1個離心管中，在35℃下真空干燥濃縮60min。此過程有助于NH4HCO3的分解并揮發(fā)，降低樣品中鹽的濃度。繼續(xù)干燥濃縮至樣品量到100μL左右，加0.1%甲酸溶液定量至所需要的樣品濃度，并注意觀察樣品溶液是否澄清。若樣品溶液有渾濁狀，需在12 000～14 000r/min條件下離心10 min，取上清液進樣分析。

1.4.4 差異表達蛋白的鑒定 本實驗使用MSeTM無標記定量技術，通過利用 Waters nano－Acquity納升流速超高效液相（nanoUPLC）WatersQ-TOF高分辨飛行時間質譜儀聯(lián)用技術，對大鼠的肝組織蛋白提取液進行定性定量比對。為確保數(shù)據(jù)的精確性和重現(xiàn)性，所有實驗均進行標準品（Enolase）、空白、實際樣品進樣3次或以上，連續(xù)進樣以及隔天進樣的嚴格測試。并在大鼠（M＿musculus）蛋白數(shù)據(jù)庫中加入標準品（P00924）的蛋白序列進行數(shù)據(jù)庫搜索。在ProteinLynx Global ServerTM2.3搜索的條件設置上，所有進行定量蛋白必須同一樣品重復出現(xiàn)2次或以上（3次），最大限度確保數(shù)據(jù)的可靠性和重現(xiàn)性。

2 結果與討論

蛋白質組技術是后基因組時代基因功能研究的重要內(nèi)容，其中2DE/MS是目前蛋白質研究中使用最為廣泛的方法。雖然2DE/MS技術在一次分析中可以分離、識別上千種蛋白質，但整個過程包括2DE、蛋白質點切割、蛋白酶解、多肽混合物提取及質譜分析等多個步驟的手工操作，存在耗時長、重復性較差、自動化程度低等缺點，同時蛋白的分離還受到豐度、疏水性、pH值和分子質量范圍等因素的限制。色質聯(lián)用是近幾年發(fā)展迅速的方法。蛋白質混合物直接通過液相色譜分離，然后進入質譜獲得分子質量信息并對蛋白進行鑒定。超高效液相色譜（UPLC）是近年來液相色譜技術的新發(fā)展，通過增加液相系統(tǒng)耐高壓性能，降低色譜柱固定相粒徑、色譜柱內(nèi)徑及長度，從而減小了理論塔板高度、增加了理論塔板數(shù)，實現(xiàn)了縮短分析時間、增加色譜峰容量，提高分離度和靈敏度的作用，可以滿足對色譜分析的高效、快速、高通量等性能的要求。同時，超高效液相色譜與質譜聯(lián)用也使得質譜檢測的靈敏度顯著提高。

蛋白質組學定量方法分為相對定量和絕對定量兩部分：相對定量蛋白質組學（也稱比較蛋白質組學）是指對不同生理病理狀態(tài)下，細胞、組織或體液蛋白質表達量進行的相對比較分析，如基于二維凝膠電泳（2-DE）技術直接對處于不同狀態(tài)下蛋白質表達變化的比較分析［12］、熒光膠內(nèi)差示電泳技術（differential in-gel electrophoresis，DIGE）［13］、基于同位素親和標簽（isotope coded affinity tags，ICAT）與質譜分析結合的相對定量技術［14－15］、等量標簽相對定量方法（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）［16］和金屬元素絡合物標簽結合質譜相對定量方法等［17］；無標記（1abel-free）蛋白質組絕對定量原理對質譜數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，通過對不同濃度下蛋白質檢測到的肽段數(shù)目、鑒定的概率得分、被鑒定肽段的離子數(shù)、色譜保留時間等研究，蛋白質的濃度經(jīng)一些相應的數(shù)學變換后（如指數(shù)變換）與質譜數(shù)據(jù)的某些參數(shù)呈現(xiàn)一定的線性關系。這一發(fā)現(xiàn)，可以根據(jù)肽段的質譜數(shù)據(jù)，間接的估計蛋白混合物中單一蛋白的絕對量［18］。本實驗利用ExpressionE無標識量化系統(tǒng)能夠在試驗的相對或絕對蛋白質濃度下，為所有需要的蛋白質提供獨特的識別能力。高帶寬的UPLC MSE數(shù)據(jù)采集功能與利用多肽段、無標識的蛋白質量化識別功能集于一體，采用先進的統(tǒng)計分析技術，綜合地繪制出復雜生物系統(tǒng)的結構圖譜。

本實驗使用Waters公司獨家專利LC/MSE無標記定量技術（ExpressionELabel Free Quantities），通過利用Waters nanoAcquity納升流速超高效液相Waters Q-TOF高分辨飛行時間質譜聯(lián)用技術，將大鼠肝移植術后3天和7天的肝組織經(jīng)過樣品前處理后，可直接進行上樣。大鼠肝移植術后7天的肝組織色譜圖示于圖1。

圖1 nanoUPLC-MS/MS分析大鼠肝移植術后7天肝組織的色譜圖Fig.1 nanoUPLC-MS/MS analysis of the sample chromatogram after 7days of liver transplantation in rats

近幾年，蛋白質組學與代謝組學開始被應用到器官移植的同種異體排異反應以及排異反應相關生物標記物的發(fā)現(xiàn)等領域［8］。Vascotto等［9］應用2-DE 和 MALDI-TOF-MS 技 術 發(fā)現(xiàn)肝移植供體肝臟中有36個蛋白在缺血再灌注損傷時發(fā)生明顯變化，其中多數(shù)蛋白在脂質和能量代謝、氧化還原信號以及氧化應激過程中發(fā)揮作用。張春潮等［10］利用熒光差異顯示雙向凝膠電泳，并整合內(nèi)標法與正、反相熒光標記，對急性排異組和對照組大鼠肝移植后的肝組織蛋白質表達譜進行了定量蛋白質組學研究，實驗結果有助于進一步了解器官移植排異反應的分子機制。

本實驗是在封閉群SD和Wistar之間建立大鼠原位肝移植模型，但術后存活時間較文獻報道明顯延長，出現(xiàn)了自然耐受現(xiàn)象。為了驗證和進一步探索這種現(xiàn)象，使用MSeTM無標記定量技術，通過利用 Waters nanoAcquity納升流速超高效液相 WatersQ-TOF高分辨飛行時間質譜聯(lián)用技術，對肝移植后不同時間的肝組織進行定量蛋白質組學研究。在大鼠肝移植后3天和7天的肝組織中共鑒定出表達的蛋白111個，其中表達量差異有顯著的統(tǒng)計學意義的（P＜0.05）蛋白48個，示于圖2。蛋白在大鼠肝移植后7天與3天的表達量比值大于1.5時，表示蛋白表達量上調(diào)，小于0.67則表示下調(diào)。兩樣品中同時存在的大部分蛋白上調(diào)，最多達到23.81倍。這些表達量差異的蛋白的分子功能主要與細胞骨架、離子結合、氧化應激反應、能量代謝相關，列于表1。Beta-ETF是一種含有黃素核苷酸輔基的電子載體蛋白，它存在于生物體細胞線粒體膜上，起傳遞電子作用，是作為還原型脂肪乙酰輔酶A脫氫酶和電子傳遞體系之間的一個連結環(huán)節(jié)。F-ATPase delta subunit包括F1：親水部分 （動物：α3β3γδε亞基復合體、OSCP、IF1亞基），線粒體內(nèi)膜的基質側顆粒狀突起，催化ATP合成。F0：疏水部分（ab2c9～12亞基，動物還有其他輔助亞基），鑲嵌在線粒體內(nèi)膜中，形成跨內(nèi)膜質子通道。ATP合酶組成可旋轉的發(fā)動機樣結構：F0的2個b亞基的一端錨定F1的α亞基，另一端通過δ和α3β3穩(wěn)固結合，使a、b2和α3β3、δ亞基組成穩(wěn)定的定子部分。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是內(nèi)質網(wǎng)/肌漿網(wǎng)主要的Ca2＋結合蛋白，在細胞功能的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。圖3、圖4為選取的清晰的MS/MS譜圖，通過ProteinLynx Global Server軟件對肽段碎片做詳細裂解分析，顯示出此方法對肽段測序有較高的可靠性。大鼠肝移植術后7天與3天相比，這些蛋白質表達量的增加說明大鼠的肝臟正在再生和恢復過程之中，與術后存活時間長，出現(xiàn)自然耐受現(xiàn)象相一致，但就其各個蛋白在自然耐受中的機制還有待于進一步的研究。

圖2 Protein Lynx Browser軟件分析差異蛋白表達水平Fig.2 Protein Lynx Browser software to analyze differences in protein levels

表1 大鼠肝移植后3天和7天肝組織中表達明顯上調(diào)的蛋白Table 1 Proteins markedly up-regulated during liver regeneration 3dand 7dafter liver transplantation in rats

圖3 大鼠肝移植術后3天protein（disulfide isomerase OS Mus musculus GN P4hb）中肽段MS/MS譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of peptide from protein（disulfide isomerase OS Mus musculus GN P4hb）identified by ProteinLynx Global ServerTMsoftware after 3days of liver transplantation in rats

圖4 大鼠肝移植術后7天Beta-Globin（OS Mus musculus GN Hbb b1）中肽段MS/MS譜圖Fig.4 MS/MS spectrum of peptide from Beta-Globin（OS Mus musculus GN Hbb b1）identified by ProteinLynx Global ServerTMsoftware after 7days of liver transplantation in rats

綜上所述，本實驗建立了應用nanoUPLCMS/MS技術研究大鼠同位肝移植術后不同時間差異表達蛋白質的蛋白質組學方法，并對其進行了初步的分析，驗證了 Wistar→SD大鼠肝移植術后自然免疫耐受現(xiàn)象的存在，為大鼠肝移植模型的建立奠定了實驗基礎和數(shù)據(jù)支持。在目前技術平臺上，蛋白及多肽的鑒定數(shù)據(jù)已基本滿足該模型的建立，如果需要做進一步的數(shù)據(jù)深入分析（如未知蛋白和多肽的研究方向），也可以在蛋白鑒定后對數(shù)據(jù)再進行從頭測序（De Novo Sequencing）。

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nanoUPLC Q-TOF MS/MS Analysis of Potential Biomarker in Liver Transplant Between Sprague Dawley（SD）and Wistar

XUE Yuan-zhen1，RUI Wen2，WANG Hui3
（1.Waters Technologies Limited，Guangzhou510170，China；2.Institute of Materia Medica，Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou510006，China；3.School of life Science，Capital Normal University，Beijing100037，China）

Novel approaches for the qualitative and quantitative proteomics analysis by nanoscale LC/MS was applied to the study of protein expression respond in organ transplant.In this experiment nanoUPLC Q-TOF-based LC-MS/MS platforms was evaluated for shotgun proteomics by compare the protein level after the liver transplant between Sprague Dawley（SD）and Wistar.A brand new technology label-free LC/MS called MSeTMfrom a nanoUPLC and Q-TOF（Waters）was applied attempt to establish a scientific model to for the liver transplant between Sprague Dawley（SD）and Wistar.The result is most of the protein found in the model are up-regulated between the 3days sample and the 7days sample after transplant.The novel LC/MS technology provides a fast and reliable research platform in the modeling of transplant proteomic research，provides the opportunities for discovery of new potential biomarkers.

biomarkers；nanoUPLC；LC-MS/MS；liver transplant；proteomics

薛元臻（1977～），男（漢族），廣東人，博士，生物技術專業(yè)。E-mail：johnxyz88＠hotmail.com

O 657.63

A

1004-2997（2011）05-0314-07

2010-11-30；

2011-06-01