王雪穎，張養(yǎng)軍，王 昕，3，

佟 巍2，秦偉捷2，毛心麗1，2，錢小紅2

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110015；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.防化指揮工程學(xué)院，北京 102205）

一種蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析中快速胍基化新方法

王雪穎1，2，張養(yǎng)軍2，王 昕2，3，

佟 巍2，秦偉捷2，毛心麗1，2，錢小紅2

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110015；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.防化指揮工程學(xué)院，北京 102205）

胍基化修飾在蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定及定量研究中發(fā)揮著重要的作用，本研究建立了一種蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析中微波輔助快速胍基化的新方法。采用標(biāo)準(zhǔn)肽段系統(tǒng)地優(yōu)化了反應(yīng)溶劑p H值、O-甲基異脲的濃度及微波加熱時(shí)間，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)肽段在p H 12的氨水溶液中，O-甲基異脲的濃度為1.5 mol/L，微波高火加熱1 min的胍基化效率為99%。將此方法應(yīng)用于馬心肌紅蛋白和牛血清白蛋白胰蛋白酶酶切肽段，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果表明，含賴氨酸肽段的平均胍基化效率（95%）大于文獻(xiàn)報(bào)道的平均胍基化效率（85%）。與傳統(tǒng)水浴加熱胍基化方法相比，微波輔助加熱胍基化方法縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了反應(yīng)效率，降低了肽段N端副反應(yīng)。

胍基化；微波輔助；肽；蛋白質(zhì)定量

胍基化是多肽和蛋白質(zhì)重要的化學(xué)修飾之一。經(jīng)胍基化反應(yīng)，多肽的賴氨酸（lysine）轉(zhuǎn)化為高精氨酸，其原理示于圖1。胍基化反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于提高多肽在基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）質(zhì)譜中的離子化效率和信號(hào)強(qiáng)度［1－2］；改變多肽在質(zhì)譜中的碎片裂解效率以改善多肽的二級(jí)譜圖質(zhì)量和提高多肽的覆蓋率［3］；或根據(jù)研究的需要特異性地封閉賴氨酸的ε－氨基［4－6］。胍基化反應(yīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)的相對(duì)定量研究中也有應(yīng)用，例如Carabetta等［7］采用金屬內(nèi)切蛋白酶Lys-N酶切方法結(jié)合15N/14N標(biāo)記的O-甲基異脲試劑進(jìn)行胍基化反應(yīng)，在提高了離子化效率和檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌（E.coli）中多A聚合酶I（PAPI）蛋白質(zhì)的相對(duì)定量。但是，目前報(bào)道的各種胍基化方法仍存在不足，一是胍基化反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，文獻(xiàn)報(bào)道的有30 min［8］、2 h［5－6］、過夜［7］甚至4天的反應(yīng)時(shí)間［9］；二是胍基化的反應(yīng)效率還有待提高，Beardsley等［10］考察了血紅蛋白（hemoglobin）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin）和新月柄桿菌（caulobacter crescentus）中的ctr A蛋白酶切肽段的胍基化反應(yīng)情況，3種蛋白酶切肽段的平均胍基化效率僅為85%。

為了解決這些問題，本研究選用具有揮發(fā)性的氨水為胍基化堿性溶劑，通過微波高火加熱的方式，建立一種新型快速的胍基化方法，并與傳統(tǒng)水浴加熱方式做比較。

圖1 胍基化反應(yīng)原理示意圖Fig.1 The reaction schematic diagram of guanidination

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

4800基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó) ABsciex公司產(chǎn)品；Sartorius BP211d分析天平：瑞士Sartorius公司產(chǎn)品；Thermo Orion MODEL 818 p H計(jì)：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；微波爐：廣東Galanz公司產(chǎn)品；C18 zip tip脫鹽柱：美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)肽段（色譜方法測(cè)定純度為99%，絕對(duì)含量70%）：上海吉爾生化公司產(chǎn)品；馬心肌紅蛋白、牛血清白蛋白：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；α－氰基-4-羥基肉桂酸（St.Louis，MO）：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇和測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（Madison，WI）：美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；三氟乙酸、O－甲基異脲半硫酸鹽、碘乙酰胺：美國(guó) Acros Organics公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純，Phillipsburg，ΜSA）：美國(guó)J.T.Baker公司產(chǎn)品；乙酸、氨水等其他試劑為分析純：北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng) Milli-Q A10型純水儀制備（Bedford，MA）：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)肽段的胍基化反應(yīng)條件優(yōu)化

取1μL 1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)肽段（DVDPGEHYIIK，相對(duì)分子質(zhì)量1 285.64），加入5μL 25%的氨水，依次改變O-甲基異脲終濃度（50，100，200，400，600，1 000，1 500 mmol/L）、溶液 p H值（9.0，10.0，10.5，11.0，11.5，12.0，13.0）和微波高火加熱時(shí)間（15，30，60，90，120 s）等反應(yīng)條件，再加入25μL 10%三氟乙酸（TFA）中止反應(yīng)，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，計(jì)算峰強(qiáng)度比值H1327/（H1327＋H1285），來評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)肽段的胍基化反應(yīng)程度及特異性。

1.4 蛋白質(zhì)酶切

將100μg馬心肌紅蛋白（Myoglobin）溶于100μL 50 mmol/L碳酸氫銨緩沖液中，95℃加熱變性10 min后，冷卻到室溫，加入2μg胰蛋白酶，37 ℃ 孵育，分別在 5、10、15、20、25、30 min，1、2 h，過夜等不同時(shí)間段后各取5μL酶切液，然后加入100 m L水，微波高火加熱到95℃，加入酶切樣品，低火微波加熱5～10 min，中止酶切反應(yīng)。最后將各時(shí)間點(diǎn)的酶切液混合。

將100μg牛血清白蛋白（BSA）溶解于50 μL 8 mol/L 尿 素 （含 10 mmol/L DTT，50 mmol/L NH4HCO3緩沖液，p H 8.0）中，37 ℃溫育1 h，加入IAA使其終濃度為50 mmol/L，室溫放置于暗處2 h，加入50 mmol/L緩沖液使反應(yīng)體系中尿素終濃度小于1 mol/L，加入2μg胰蛋白酶，37℃孵育過夜，微波輔助加熱中止酶切反應(yīng)。

1.5 傳統(tǒng)水浴胍基化與微波輔助加熱胍基化

1.5.1 傳統(tǒng)水浴加熱胍基化方法［11］取1μL 1 g/L馬心肌紅蛋白酶切液，加入5.5μL 7 N氨水混勻，再加入1.5μL 7.9 mol/LO-甲基異脲，渦旋混勻，65℃水浴恒溫5～10 min，最后加入15μL 10%的TFA終止反應(yīng)。用Zip Tip C18反相小柱脫鹽，分別用100%和50%乙腈沖洗小柱，然后用10μL 0.1%TFA平衡脫鹽柱，上樣10μL，最后用5μL 80%ACN/0.1%TFA 洗脫。脫鹽完成后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.5.2 微波輔助加熱胍基化方法 取1μL 1 g/L馬心肌紅蛋白酶切液，加入5μL 25%的氨水（p H 12），渦旋混勻，加入新鮮配制的O-甲基異脲，使其終濃度為1.5 mol/L，混勻后高火微波1 min。然后加入25μL 10%的TFA終止反應(yīng)。用Zip Tip C18反相小柱脫鹽，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.6 牛血清白蛋白胰蛋白酶酶切肽段胍基化反應(yīng)

取上述1μL 1 g/L牛血清白蛋白胰酶酶切肽段，加入5μL p H 12的氨水，渦旋混勻，再加入現(xiàn)配制的O-甲基異脲，使其終濃度為1.5 mol/L，混勻后高火微波1 min。然后加入25μL 10%的TFA終止反應(yīng)。用Zip Tip C18反相小柱脫鹽，取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，計(jì)算峰強(qiáng)度比值H原肽段/（H原肽段＋H胍基化肽段），來評(píng)估肽段的胍基化反應(yīng)效率及特異性。

1.7 質(zhì)譜分析條件

待測(cè)樣品混合基質(zhì)（α－氰基-4-羥基肉桂酸）溶液點(diǎn)靶分析。上樣量為1 pmol，馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段作為標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)儀器進(jìn)行外標(biāo)校正，校準(zhǔn)至誤差≤0.1 u，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10 ppm。一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用MS－positive反射模式，掃描范圍600～3 500，激光能量5 000，每張譜圖累加800次。二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MS/MS-1 k V反射模式，從一級(jí)譜圖中選擇信噪比大于20的峰，母離子選擇范圍設(shè)定其相對(duì)分辨率為150，激光能量為5 500，每張譜圖累加1 200次。儀器控制軟件為4800Exp LorerTMsoftware。本研究所有質(zhì)荷比（m/z）均為單同位素峰質(zhì)量數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)肽段胍基化反應(yīng)條件優(yōu)化

影響胍基化反應(yīng)的主要因素包括：反應(yīng)體系的p H值、O-甲基異脲的濃度、反應(yīng)的溫度等。本研究通過改變傳統(tǒng)的水浴加熱方式，采用高火微波加熱方式，并從溶劑種類、反應(yīng)溶劑p H值、O－甲基異脲的濃度、微波時(shí)間等方面對(duì)胍基化反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 胍基化反應(yīng)溶劑的選擇 胍基化反應(yīng)在堿性環(huán)境中進(jìn)行，常用的堿性試劑有氫氧化鈉［2，12］、碳酸鈉［1，3］、氨水［11，13］。由于氨水具有揮發(fā)性，容易從反應(yīng)體系中除去，可減少質(zhì)譜分析時(shí)［M＋Na］＋峰的干擾，故本實(shí)驗(yàn)選用氨水為反應(yīng)溶劑。

2.1.2 反應(yīng)溶液p H的優(yōu)化 反應(yīng)體系的p H值是影響胍基化效率的關(guān)鍵因素之一。從反應(yīng)原理分析，在強(qiáng)堿性條件下有利于賴氨酸ε－氨基（p Ka＝10.53）的去質(zhì)子化從而使反應(yīng)順利進(jìn)行；同時(shí)鑒于在p H大于13.6時(shí)多肽將發(fā)生水解副反應(yīng)［12］，實(shí)驗(yàn)考察了在25%的氨水溶劑中，p H值在9～13.5，O-甲基異脲的終濃度為1.5 mol/L，微波輔助加熱1 min條件下的胍基化反應(yīng)效率，反應(yīng)結(jié)果示于圖2a。隨著反應(yīng)體系的p H增加至12，胍基化的反應(yīng)效率達(dá)到最大值97%，p H值再增加則胍基化效率幾乎保持不變。所以，最佳的p H值是11.5～13，此區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)肽段的胍基化反應(yīng)效率可達(dá)95%以上。

2.1.3O-甲基異脲濃度的優(yōu)化 文獻(xiàn)報(bào)道常用的胍基化試劑有：O-甲基異脲硫酸氫鹽、O-甲基異脲半硫酸鹽、氨基氰、吡唑-1-羧酰胺、S-甲基-硫脲及其衍生物［14］，因O-甲基異脲硫酸氫鹽或O-甲基異脲半硫酸鹽對(duì)賴氨酸側(cè)鏈反應(yīng)的專一性強(qiáng)，故多選擇O-甲基異脲試劑。另外O-甲基異脲硫酸氫鹽是由一分子HSO4-和一分子O－甲基異脲組成，其飽和溶液p H值為0.76；而O－甲基異脲半硫酸鹽是由一分子O-甲基異脲和1/2分子SO42－組成，其飽和溶液p H 值為2.60［11］。O-甲基異脲半硫酸鹽對(duì)胍基化反應(yīng)體系的p H值影響小，故選用此試劑。

O－甲基異脲半硫酸鹽的濃度也是直接影響胍基化效率的重要因素之一。圖2b顯示了25%氨水溶液、p H值為12時(shí)，O-甲基異脲半硫酸鹽的終濃度從0.1～1.5 mol/L變化所對(duì)應(yīng)的胍基化效率，在1 mol/L和1.5 mol/L時(shí)，胍基化效率為96%以上，終濃度為1.5 mol/L時(shí)，反應(yīng)效率最高為99%。

2.1.4 微波輔助加熱時(shí)間的優(yōu)化 縮短化學(xué)反應(yīng)的時(shí)間以減少由于反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)而引起的副反應(yīng)、提高研究的效率和加快整個(gè)研究的進(jìn)程等為優(yōu)化反應(yīng)條件的共同目標(biāo)之一。傳統(tǒng)的縮短胍基化反應(yīng)時(shí)間的手段是水浴加熱，如Chervenka等［9］對(duì)胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）進(jìn)行胍基化反應(yīng)時(shí)，在4℃反應(yīng)4天；當(dāng)反應(yīng)溫度提高到37℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間縮短到2 h［5］。Rich-ard等［11］在水浴65℃時(shí)對(duì)肽段進(jìn)行胍基化，反應(yīng)時(shí)間縮短到5～10 min。

微波加熱不同于一般的溫度從高向低的熱傳導(dǎo)過程，溫度的升高直接發(fā)生于被加熱物體內(nèi)部而不是發(fā)生于加熱腔內(nèi)或是在容器上，所以微波加熱具有加熱速度快，加熱均勻的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要考察了標(biāo)準(zhǔn)肽段微波高火15、30、60、90、120 s的反應(yīng)，結(jié)果示于圖2c，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)肽段在30 s～2 min胍基化效率都達(dá)96%以上，反應(yīng)時(shí)間低于文獻(xiàn)報(bào)道的5～10 min［11］。分析原因，可能是微波加熱提高了反應(yīng)速率。

2.2 水浴加熱與微波輔助加熱胍基化方法的比較

選用肌紅蛋白胰酶酶切肽段為模型，按文獻(xiàn)［11］報(bào)道的水浴方法與微波輔助胍基化方法分別進(jìn)行胍基化反應(yīng)。并按不同時(shí)間點(diǎn)將酶切所產(chǎn)生的含漏切位點(diǎn)的馬心肌紅蛋白肽段與過夜酶切的肽段混合，以便考察微波輔助胍基化方法對(duì)含漏切位點(diǎn)肽段和無(wú)漏切位點(diǎn)肽段胍基化的反應(yīng)效率。

在25%氨水（p H 12），O-甲基異脲終濃度為1.5 mol/L，微波高火加熱1 min的條件下反應(yīng)，馬心肌紅蛋白酶切肽段胍基化反應(yīng)結(jié)果示于表1和圖3，水浴方法與微波輔助胍基化方法都能使無(wú)漏切位點(diǎn)肽段（peptide 1-7）胍基化效率達(dá)到98%以上，對(duì)含有漏切位點(diǎn)的肽段（peptide 8-14）胍基化效率可達(dá)到95%，但微波輔助加熱的方法更占優(yōu)勢(shì)。隨著賴氨酸數(shù)量的增多，肽段的（peptide 16）胍基化反應(yīng)效率降低。所選肽段胍基化反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。

圖2 不同條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段胍基化反應(yīng)效率的影響a.氨水的p H值；b.O-甲基異脲的濃度；c.微波加熱時(shí)間Fig.2 Different reaction conditions on guanidination efficiencies of standard peptide a.p H of ammonia；b.concentration of O-methylisourea hemisulfate；c.time of microwave heating

在對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)N端伯胺基也會(huì)發(fā)生修飾反應(yīng)。N端伯胺基與O-甲基異脲的反應(yīng)與N端氨基酸種類有關(guān)，在馬心肌紅蛋白酶切肽段微波加熱方法中，以Y、L、H、F、A、G氨基酸為N端的肽段都發(fā)生了副反應(yīng)。其中以A（peptide 1）、G（peptide 6）為 N 端的肽段的胍基化效率分別為5%和16%。Y、L、H、F氨基酸為N端的氨基胍基化效率在1.5%以下，可忽略。A和G為N端的肽段胍基化的原因可能是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，空間位阻小，導(dǎo)致副反應(yīng)的可能性增大。而這兩個(gè)肽段在水浴加熱方式反應(yīng)中副反應(yīng)分別為7%和22%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11］，在馬心肌紅蛋白和細(xì)胞色素C酶切肽段水浴加熱方式胍基化數(shù)小時(shí)，M、S、V、L、F、E、A 都會(huì)發(fā)生副反應(yīng)。相比之下，由于微波輔助胍基化可在1 min完成，因此副反應(yīng)更少。

在分析肽段N端副反應(yīng)時(shí)，其中以A為N端的肽段（peptide 1）質(zhì)量數(shù)為748.4，N端被胍基化后質(zhì)量數(shù)增加為790.4，同時(shí)肌紅蛋白含一個(gè)漏切位點(diǎn)的肽段質(zhì)量數(shù)增加也為790.4，為了驗(yàn)證748.4的N端是否被胍基化，在 MALDITOF-TOF質(zhì)譜上做了二級(jí)質(zhì)譜分析，比較b、y離子是否匹配。當(dāng)N端被修飾，b離子質(zhì)荷比增加42，而y離子不變。y離子的信號(hào)強(qiáng)于b離子，所以實(shí)驗(yàn)著重觀察了y離子是否匹配。如圖4所示，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)790.4肽段的y離子與748.4完全匹配，從而證明了以丙氨酸為N端的肽段的確發(fā)生了胍基化反應(yīng)。其他N端是否發(fā)生副反應(yīng)也可以通過此方法進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段胍基化前（a）和胍基化后（b）的 MALDI-TOF/TOF-MS圖Fig.3 MALDI-TOF/TOF mass spectra of peptides from myoglobin before guanidination（a）and after microwave-assisted guanidination（b）

圖4 馬心肌紅蛋白酶切肽段T135-140（ALELFR）N端被修飾前（a）和被修飾后（b）的 MALDI-TOF/TOF-MS的二級(jí)圖Fig.4 MALDI-TOF/TOF MS/MS spectra of pepetide1 before（a）and after（b）guanidination

2.3 微波輔助加熱胍基化方法的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證微波輔助加熱胍基化方法的可靠性，選擇牛血清白蛋白（BSA）胰蛋白酶酶切肽段進(jìn)行胍基化反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2。在質(zhì)譜所鑒定到的26個(gè)以賴氨酸為C端的肽段中，其中有11個(gè)肽段的胍基化效率達(dá)98%以上，8個(gè)肽段的胍基化達(dá)到90%以上，6個(gè)肽段的胍基化效率82%以上，1個(gè)含脯氨酸肽段的胍基化為50%。所選肽段胍基化反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。證明了本實(shí)驗(yàn)建立的胍基化方法的普適性。實(shí)驗(yàn)所選擇的兩個(gè)蛋白質(zhì)（馬心肌紅蛋白和牛血清白蛋白）含賴氨酸肽段的平均胍基化效率（95%）大于文獻(xiàn)報(bào)道的平均胍基化效率（85%）［10］。 另 外， 肽 段 （RPCFSALTPDETYVPK）的胍基化效率僅為50%，其原因可能是脯氨酸的吡咯環(huán)的空間位阻大，影響賴氨酸側(cè)鏈氨基的胍基化反應(yīng)。

對(duì)于肽段N端副反應(yīng)的考察，不僅觀察了BSA以R結(jié)尾的肽段，也考察了理論酶切肽段賴氨酸側(cè)鏈氨基完全胍基化后的N端是否發(fā)生修飾。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此副反應(yīng)不但與N端氨基酸的種類有關(guān)，也與肽段本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。其中以L、E、G、S氨基酸為N端的肽段，副反應(yīng)胍基化效率超過15%，以A為N端的肽段副反應(yīng)為5%。除了以 W、P、I、F這4個(gè)氨基酸為N端的肽段在BSA的肽段沒有考察到，其余以D、H、M、V、T、C、N、R、Q、Y為 N 端的肽段沒有發(fā)現(xiàn)胍基化副反應(yīng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了傳統(tǒng)胍基化的方法。采用微波輔助加熱1 min，在p H 11.5～13的氨水溶液中，O-甲基異脲半硫酸鹽的終濃度在1 mol/L和1.5 mol/L時(shí)，馬心肌紅蛋白和牛血清白蛋白胰酶酶切且含賴氨酸肽段的平均胍基化效率（95%）大于文獻(xiàn)報(bào)道的平均胍基化效率（85%）。與水浴加熱胍基化方法相比，微波輔助加熱胍基化方法縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了反應(yīng)效率，降低了肽段N端副反應(yīng)，使得本方法在蛋白質(zhì)定性定量分析中發(fā)揮重要的作用。

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A Novel Method of Fast Guanidination in Protein Analysis

WANG Xue-ying1，2，ZHANG Yang－jun2，WANG Xin2，3，TONG Wei2，QIN Wei-jie2，MAO Xin-li1，2，QIAN Xiao-hong2
（1.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110015，China；2.State Key Laboratory of Proteomics，Beijing Proteome Research Center，Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 102206，China；3.Institute of Chemical Defense，Beijing 102205，China）

Guanidination plays an obvious role in identification and quantification of proteins.A quick microwave-assisted guanidination reaction method was established in this work.The reaction conditions，including buffer p H，concentration ofO-methylisourea hemisulfate and time of microwave heating，were optimized using a standard peptide.The peptide was microwave heated for 1 min with 1.5 mol/LO-methylisourea and near p H 12 of the mixture，the conversion rate of lysine to homoarginine was 99%.Further examination was carried out by applying this microwave-assisted guanidination method to tryptic digested peptides of myoglobin and bovine albumin.The average guanidination efficiency washigher than that reported in literature.Compared with the conventional guanidination methods，the microwave-assisted guanidination method can shorten reaction time，enhance reaction efficiency，and reduce side reactions on the N-terminal of peptides.

guanidination；microwave-assisted；peptides；protein quantification

O 657.63

A

1004-2997（2011）05-0257-08

2011-02-14；

2011-06-01

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2006AA02A308）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30621063，20635010，20735005，20875101）、973計(jì)劃（2007CB914104、2010CB912701、2011CB910603）資助

王雪穎（1988～），女（漢族），天津人，碩士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail：piaopiaoxiaoxue＠126.com

錢小紅（1955～），女（漢族），江蘇人，研究員，從事蛋白質(zhì)組學(xué)研究。E mail：qianxh1＠yahoo.com.cn