李杰茹 韓聚強(qiáng) 張利敏 趙國華 王 剛 (河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 05000)

N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮對(duì)血管性癡呆大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用

李杰茹 韓聚強(qiáng) 張利敏1趙國華2王 剛1(河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050200)

目的 觀察N-〔(2-乙酰氧基)苯甲?；?吡咯烷-2-酮(N-{(2-acetoxyl)benzoyl}-2-pyrrdidone，NABP)對(duì)血管性癡呆(VD)大鼠神經(jīng)保護(hù)研究及其機(jī)制。方法 采用改良的二血管阻斷+硝普鈉法制備VD大鼠模型，術(shù)后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、NABP 20、10、5 mg/kg和陽性對(duì)照藥尼莫地平10 mg/kg組。給藥20 d后，采用HE染色觀察大鼠皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兩腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率，雙波長熒光光度法測(cè)定兩腦區(qū)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度(〔Ca2+〕i)。結(jié)果 NABP明顯抑制模型大鼠皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞的變性壞死，可以降低兩腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率及降低兩腦區(qū)(〔Ca2+〕i)。結(jié)論 NABP具有神經(jīng)保護(hù)作用，該作用可能與其降低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣，抑制鈣超載有關(guān)。

N-〔(2-乙酰氧基)苯甲?；?吡咯烷-2-酮;血管性癡呆;凋亡;鈣

患者常伴有不同程度的智力障礙，嚴(yán)重者不僅影響患者的生存質(zhì)量，而且增加社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)。但目前臨床上尚無有效的治療辦法和控制本病的特效藥物〔1，2〕，因此VD治療藥物的開發(fā)成為新藥研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮(N-{(2-acetoxyl)benzoyl}-2-pyrrdidone，NABP)為新合成的吡咯烷類衍生物，本文采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)夾閉再灌注同時(shí)腹腔注射硝普鈉降壓法建立VD大鼠模型，觀察NABP對(duì)模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠80只，雌雄各半，體重250～300 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試驗(yàn)期間飼養(yǎng)于專用飼養(yǎng)籠內(nèi)，每盒2只，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器 NABP由河北化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院王剛副教授惠贈(zèng)，批號(hào):080612，純度為99.0%;注射用硝普鈉由北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn);尼莫地平片由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):000605;碘化乙碇:Sigma公司;Fluo-star型多功能微分析儀:德國BM公司;FACS420流式細(xì)胞儀:美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組 按性別、體重將動(dòng)物隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型對(duì)照組、NABP(20、10、5 mg/kg)組、陽性對(duì)照藥尼莫地平10 mg/kg組。

1.3.2 模型制備〔3〕參照文獻(xiàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CAA)反復(fù)夾閉再灌注同時(shí)腹腔注射硝普鈉降壓法建立血管性癡呆模型。腹腔注射35 mg/kg水合氯醛麻醉大鼠后，仰位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)CCA，在夾閉雙側(cè)CAA之前，模型對(duì)照組、NABP處理組和尼莫地平組均腹腔注射硝普鈉2.5 mg/kg，隨即用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈10 min，再通10 min，再夾閉10 min，然后縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組的麻醉及手術(shù)過程與模型組相同，但不阻斷CAA，不注射硝普鈉。

1.3.3 給藥劑量及方式 所有藥物均以蒸餾水配制成混懸液灌胃給予，每天一次，灌胃容積為1 ml/100 g體重，術(shù)后10 d開始，連續(xù)給予20 d，假手術(shù)組和模型對(duì)照組每天灌胃給予相量的蒸餾水。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查 末次給藥后1 h，每組取大鼠5只，斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)。

1.3.5 細(xì)胞凋亡的定量分析〔4〕末次給藥后每組取大鼠5只，斷頭取腦，剝離皮層及海馬組織，冷70%乙醇中固定，用機(jī)械法分散神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)300目銅網(wǎng)過濾，以0.01 mol/L PBS洗滌并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，碘化乙啶染色，F(xiàn)ACS420流式細(xì)胞儀測(cè)定，將所得數(shù)據(jù)經(jīng)Bioconsort專用軟件處理，分析細(xì)胞的凋亡百分率。

1.3.6 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度(〔Ca2+〕i)的測(cè)定〔5〕末次給藥后1 h，取每組剩余5只大鼠，斷頭取腦，剝離皮質(zhì)和海馬組織，分別置于冰冷D-Hank's液中沖洗，于DMEM培養(yǎng)液中剪碎，吸管吹打分散細(xì)胞，經(jīng)300目銅網(wǎng)過濾，離心后棄上清，以DEME培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢查，細(xì)胞成活率達(dá)90%以上。細(xì)胞懸液在37℃水浴中預(yù)溫5 min，加入5μmol/L的Fura-2/AM避光振蕩40 min進(jìn)行負(fù)載，負(fù)載后的細(xì)胞以D-Hank's液洗滌，制成1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，采用Fluo-star型多功能微分析儀，于激發(fā)波長為340和380 nm，發(fā)射波長為505 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并按文獻(xiàn)公式計(jì)算了神經(jīng)細(xì)胞〔Ca2+〕i。

2 結(jié)果

2.1 NAPB對(duì)血管性癡呆大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響 與假手術(shù)組相比，模型大鼠海馬錐體細(xì)胞及皮層細(xì)胞大量變性，部分神經(jīng)細(xì)胞胞核深染，固縮變形，給予NAPB 20、10 mg/kg或尼莫地平10 mg/kg進(jìn)行干預(yù)，可以明顯改善這種變化。

2.2 NAPB對(duì)血管性癡呆大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 模型對(duì)照組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡百分率明顯高于假手術(shù)組，灌胃給予NAPB 20、10 mg/kg或尼莫地平10 mg/kg，細(xì)胞凋亡百分率明顯降低，但NAPB 5 mg/kg對(duì)細(xì)胞凋亡百分率無明顯影響。見表1。

表1 NAPB對(duì)VD大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=5)

表1 NAPB對(duì)VD大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=5)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型對(duì)照組比較:2)P＜0.01

組別 劑量(mg/kg)海馬腦區(qū) 皮層腦區(qū)假手術(shù)組 － 1.6±0.21) 0.5±0.11)模型對(duì)照組 － 10.2±0.4 6.9±0.6尼莫地平組 10 7.3±0.51) 4.0±0.62)NABP組 20 5.4±0.92) 3.1±0.52)10 6.9±0.72) 5.2±0.22)5 9.7±0.5 6.7±0.4

2.3 NAPB對(duì)血管性癡呆大鼠神經(jīng)細(xì)胞〔Ca2+〕i的影響 模型對(duì)照組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)〔Ca2+〕i較假手術(shù)組大鼠兩腦區(qū)有明顯升高，給予NAPB 20、10mg/kg或尼莫地平10mg/kg后〔Ca2+〕i明顯降低，NAPB 5mg/kg組大鼠兩腦區(qū)〔Ca2+〕i與模型對(duì)照組〔Ca2+〕i相比無明顯變化。見表2。

表2 NAPB對(duì)VD大鼠神經(jīng)細(xì)胞〔Ca2+〕i的影響(±s，n=5)

表2 NAPB對(duì)VD大鼠神經(jīng)細(xì)胞〔Ca2+〕i的影響(±s，n=5)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型對(duì)照組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 劑量(mg/kg)海馬腦區(qū) 皮層腦假手術(shù)組 － 148±251) 159±371)模型對(duì)照組 － 346±48 328±44尼莫地平組 10 248±533) 238±313)NABP組 20 203±422) 199±402)10 246±403) 224±392)324±46 312±51 5

3 討論

VD是由于缺血或出血性腦血管疾病以及全腦缺血缺氧而引起的認(rèn)知功障礙，主要表現(xiàn)為智能衰退。血管性癡呆引起智能衰退與腦缺血造成的神經(jīng)損傷密切相關(guān)。而神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載則是引起細(xì)胞損傷的重要原因〔6〕。鈣離子(Ca2+)是維持神經(jīng)信號(hào)傳遞的重要第二信使，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平極微小的變化就有可能引起一系列變化。腦缺血后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常增高，引起鈣超載，激活鈣依賴性磷脂酶和蛋白酶，引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損害，進(jìn)一步增加膜對(duì)離子的通透性，誘發(fā)神經(jīng)凋亡或壞死〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠造模成功后，其海馬錐體細(xì)胞及皮層細(xì)胞大量變性，部分神經(jīng)細(xì)胞胞核深染，固縮變形，且兩腦區(qū)細(xì)胞凋亡百分率明顯升高，而給予NABP干預(yù)后，可以逆轉(zhuǎn)這種變化，說明NABP對(duì)腦神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。為了進(jìn)一步探討其神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制，我們又采定了兩腦區(qū)〔Ca2+〕i，結(jié)果發(fā)現(xiàn) NABP可以降低兩腦區(qū)〔Ca2+〕i，抑制由于腦缺血造成的鈣超載。當(dāng)然，大量的研究顯示，缺血后機(jī)體的抗氧化能力降低也是引起神經(jīng)損傷的原因，NABP在抑制鈣超載的同時(shí)，是否具有其他方面作用，有待進(jìn)一步研究。

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R965

A

1005-9202(2011)12-2274-02

1 河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥系 2 石家莊高等醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校

王 剛(1969-)，男，碩士，副教授，主要從事藥物藥理學(xué)研究。

李杰茹(1969-)，女，碩士，高級(jí)講師，主要從事老年抗衰老、抗癡呆研究。

〔2010-10-26收稿 2011-01-20修回〕

(編輯 劉 愉/曹夢(mèng)園)