楊 俊,王文輝,王 齊,孫曉東

(昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心,云南昆明 650093)

甲磺隆(metsulfuron-methyl)和芐嘧磺隆(bensulfuron-methyl)是磺酰脲類除草劑,具有高效、廣譜、低毒、用量少、易降解等特點(diǎn),被廣泛用于長江流域及其以南地區(qū)稻田雜草的防治[1-2]。它們能有效抑制雜草的危害,但除草劑殘留,以及對(duì)農(nóng)業(yè)環(huán)境的危害也日益嚴(yán)重。除草劑的毒性雖然比一般的殺蟲劑低得多,但長期大量使用,使其在農(nóng)作物體內(nèi)、土壤、水體中殘留,又通過食物鏈危害整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的安全。因此,對(duì)環(huán)境中除草劑殘留進(jìn)行分析檢測(cè)就顯得尤為重要。芐嘧磺隆及甲磺隆對(duì)稗草、矮慈菇、四葉萍等具有較好的防治效果,是目前移栽稻田較理想的一次性除草劑。但由于它是選擇性內(nèi)吸除草劑,殘留時(shí)間較長,如果水體中該藥殘留較高,作物易發(fā)生藥害,同時(shí)也會(huì)隨著農(nóng)田污水的排放進(jìn)入整個(gè)環(huán)境水體,危害生態(tài)系統(tǒng)安全。

目前,檢測(cè)甲磺隆和芐嘧磺隆類化合物的方法有生物測(cè)定法[3]、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法[4-5]、氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7-8]和毛細(xì)管電泳法[9]。生物測(cè)定法具有費(fèi)用小、操作簡單、精度高、能反映對(duì)植物綜合效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),但其缺乏專一性,重現(xiàn)性差。酶聯(lián)免疫分析是一種快速、有效、專一性強(qiáng)的檢測(cè)方法,但其檢測(cè)范圍僅為20～100 mg/kg,達(dá)不到農(nóng)藥殘留檢測(cè)限的要求。氣相色譜法是農(nóng)藥殘留分析的經(jīng)典方法,但由于磺酰脲類除草劑揮發(fā)性低,且對(duì)熱不穩(wěn)定,使該類化合物的直接測(cè)定受到限制,通常要進(jìn)行如偶氮甲烷衍生化、溴化戊氟芐基衍生化或水解成芳基磺酰胺等各種衍生化后,才可用氣相色譜法進(jìn)行分析,所以該方法沒有被廣泛用于磺酰脲類除草劑的殘留分析。毛細(xì)管電泳法由于要求進(jìn)樣體積低而達(dá)不到分析方法的靈敏度要求?；酋ｋ孱惢衔锞哂胁灰讚]發(fā)、對(duì)熱不穩(wěn)定的特點(diǎn),對(duì)這類化合物的測(cè)定高效液相色譜優(yōu)越于氣相色譜,所以液相色譜法是目前分析磺酰脲類化合物最常用的方法,但帶紫外檢測(cè)器的高效液相色譜法存在靈敏度低,最低檢出限只能達(dá)到0.3 μg/L,缺乏專一性,需要很多凈化前處理。本工作采用質(zhì)譜作為檢測(cè)器,利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法分析磺酰脲除草劑的痕量殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀:美國Waters公司產(chǎn)品;Acquity UPLC-Quattro Premier三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國Waters公司產(chǎn)品,配備電噴霧離子源(ESI),以及Masslynx 4.1數(shù)據(jù)采集軟件;Supelco C18固相萃取柱(500 g/3 L):美國 Supelco公司產(chǎn)品。

甲磺隆、芐嘧磺隆(純度不小于98.0%):美國Sigma公司產(chǎn)品;乙腈(色譜純):美國 Fisher公司產(chǎn)品;乙酸為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水;稻田水樣:由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)環(huán)所提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

50.0 mg/L甲磺隆、芐嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別精密稱取5.0 mg甲磺隆、芐嘧磺隆,用乙腈溶解,定容至100 mL容量瓶中,搖勻,4℃保存 ,待用。

0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別移取1.0 mL,甲磺隆、芐嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙腈定容至100 mL容量瓶中,搖勻。

1.3 色譜條件

色譜柱:Acquity UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm×1.7μm);流動(dòng)相:A液為0.05%乙酸,B液為甲醇;流速0.4 mL/min,梯度洗脫程序列于表1;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。

表1 流動(dòng)相梯度表Table 1 G rade table of mobile phase

1.4 質(zhì)譜條件

ESI+離子化,毛細(xì)管電壓3.00 kV,錐孔電壓20 V,二級(jí)錐孔電壓3 V,碰撞電壓0.2 V,離子源溫度120℃,脫溶劑氣溫度350℃,脫溶劑氣流速800 L/h,錐孔反吹氣流量20 L/h,其他參數(shù)列于表2。

表2 甲磺隆、芐嘧磺隆的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Optimized MS parameters of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl

1.5 樣品前處理

量取20.0 mL水樣(若水樣混濁,則先用0.45μm濾膜過濾),用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)p H 2.5,依次用5 mL乙腈和5 mL超純水活化固相萃取小柱;然后加入20.0 mL待測(cè)水樣,待水樣加完后,減壓抽干小柱,再用6 mL乙腈洗脫,收集洗脫液,用氮?dú)獯蹈?加乙腈定容至1.0 mL,供LC/MS測(cè)定。

2 結(jié)果和討論

2.1 液相色譜條件的建立

UPLC采用的色譜柱填料粒徑為1.7μm,與常規(guī)的5μm C18色譜柱相比,能顯著提高柱效,大大減少色譜分離所需的時(shí)間,并且其所使用的0.2～0.4 mL/min流速又恰好能與電噴霧離子化方式所匹配。

在流動(dòng)相的選擇方面,分別采用了等度洗脫(70%甲醇-0.05%乙酸)和梯度洗脫兩種方式。除了考慮色譜的分離情況,還要考慮是否與質(zhì)譜條件匹配。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-0.05%乙酸和乙腈-0.05%乙酸,發(fā)現(xiàn)采用等度洗脫方式雖然能夠很好的分離甲磺隆和芐嘧磺隆,但其峰型較差,示于圖1;而采用梯度洗脫方式,甲磺隆和芐嘧磺隆的分離度和峰型均較好,故采用梯度洗脫方式進(jìn)行甲磺隆和芐嘧磺隆的分離,示于圖2。

2.2 質(zhì)譜條件的建立

通過對(duì)甲磺隆(C14H15N5O6S)和芐嘧磺隆(C16H18N4O7S)的結(jié)構(gòu)分析,相對(duì)分子質(zhì)量分別為381.4和410.4,母離子分子離子峰[M+H]+分別為 m/z382.4和 m/z411.4。采用直接進(jìn)樣方式將質(zhì)量濃度為0.5 mg/L甲磺隆和芐嘧磺隆混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中,在正離子檢測(cè)方式下分別進(jìn)行母離子全掃描,得到甲磺隆和芐嘧磺隆的母離子峰。分別對(duì)兩者的一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)(如毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速等)進(jìn)行優(yōu)化,使甲磺隆和芐嘧磺隆母離子的離子強(qiáng)度達(dá)到最佳,然后以此母分子離子峰為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖,得到相應(yīng)的碎片離子信息,對(duì)二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)(如碰撞電壓,碰撞氣流速等)進(jìn)行優(yōu)化,使特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)溶劑氣流速等優(yōu)化,以使甲磺隆和芐嘧磺隆的母離子的離子強(qiáng)度達(dá)到最佳,得到的甲磺隆和芐嘧磺隆二級(jí)質(zhì)譜圖分別示于圖3、圖4。選擇m/z381.9＞m/z167.0作為甲磺隆定性、定量離子,m/z411.0＞m/z149.1作為芐嘧磺隆定性、定量離子。

圖1 甲磺隆、芐嘧磺隆等度洗脫色譜圖Fig.1 Chromatography of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl with isocratic elution

圖2 甲磺隆、芐嘧磺隆梯度洗脫色譜圖Fig.2 Chromatography of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl with gradient elution

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

由于在酸性條件下,弱酸性的甲磺隆和芐嘧磺隆以分子狀態(tài)存在,易與固相萃取柱中的固相材料結(jié)合,從而保留在固相萃取柱中,因此過柱之前將樣液調(diào)至p H 2.5。

比較乙腈和甲醇的洗脫效果,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用甲醇作為洗脫液時(shí),其待測(cè)組分的回收率較乙腈低,故選用乙腈作為洗脫液。

圖3 甲磺隆的 ESI-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.3 ESI-MS/MS mass spectrum of metsulfuron-methyl

圖4 芐嘧磺隆的ESI-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.4 ESI-MS/MS mass spectrum of bensulfuron-methyl

洗脫液體積的優(yōu)化:為了確定乙腈洗脫液的用量,采用在空白水樣中加標(biāo),用10.0 mL乙腈按 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL 分段洗脫并收集,吹干后定容至1.0 mL,進(jìn)行色譜分析。實(shí)驗(yàn)表明,在洗脫液體積為6.0 mL時(shí),檢測(cè)不出甲磺隆和芐嘧磺隆,故固相萃取時(shí),乙腈的用量為6.0 mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別移取 0.2、2.0、10.0、20.0 mL 甲磺隆、芐嘧磺隆混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈定容至100 mL,配成 1.0、10.0、50.0、100.0、500.0μg/L 含甲磺隆和芐嘧磺隆的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)UPLC-MS/MS測(cè)定后,分別以甲磺隆和芐嘧磺隆為定量離子,色譜峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到甲磺隆的回歸方程為y=788.73x-3 653,r=0.999 7,芐嘧磺隆的回歸方程為y=508.64x-1 291.3,r=0.999 9。甲磺隆和芐嘧磺隆在1.0～500.0μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢出限

取20.0 mL水樣分析,最終定容體積為1.0 mL,進(jìn)樣量10μL,在空白水樣品中添加甲磺隆和芐嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)得稻田水體中甲磺隆和芐嘧磺隆的檢出限(S/N=3)分別為0.002 5μg/L和0.005μg/L。

2.6 回收率和精密度

分別準(zhǔn)確吸取0.1、0.2、0.4 mL甲磺隆、芐嘧磺隆混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用空白水樣定容至20 mL,按2.5項(xiàng)方法制備供試液,進(jìn)行色譜及質(zhì)譜條件的測(cè)定,計(jì)算甲磺隆和芐嘧磺隆的回收率以及測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,每組樣品平行測(cè)定6次,結(jié)果列于表3。由表3可知,在添加水平2.5～20.0μg/L時(shí),其回收率為 87.6%～98.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～3.5%?？瞻姿畼蛹訕?biāo)的UPLC-MS/MS總離子流色譜圖,示于圖5。

2.7 樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法檢測(cè)從稻田中采集的10批水樣,樣品中甲磺隆和芐嘧磺隆的含量為0.75～10.2μg/L,結(jié)果列于表4。

表3 標(biāo)準(zhǔn)加入空白水樣中甲磺隆和芐嘧磺隆的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recovery and RSD of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl in the samples of standard addition(n=6)

圖5 空白水樣加標(biāo)的UPLC-MS/MS總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatograms of a blank sample spiked standard

表4 不同水樣中,甲磺隆和芐嘧磺隆殘留量檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of metsulfuron-methyl and bensulfuron-methyl contents in some selected paddyfield w ater

3 結(jié)論

本方法適用于同時(shí)檢測(cè)稻田水體中甲磺隆和芐嘧磺隆的殘留。實(shí)驗(yàn)表明,UPLC-MS/MS對(duì)于稻田水體中甲磺隆和芐嘧磺隆的殘留分析,是一種靈敏度高、重現(xiàn)性好的定性、定量方法。在水樣只有20倍濃縮的情況下,檢測(cè)限可達(dá)0.002 5μg/L和0.005μg/L,可以通過加大處理水樣的量繼續(xù)降低檢測(cè)限。

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