張召才， 嚴(yán) 靜， 虞意華， 顏默磊， 呂曉春

(浙江醫(yī)院ICU，浙江 杭州310013)

心肌纖維化是病毒性心肌炎常見(jiàn)病理變化，是患者出現(xiàn)心律失常、心功能減退甚至心臟性猝死等并發(fā)癥的重要原因［1］。既往認(rèn)為心臟原位(heartresident)的成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)b)受炎癥等刺激后增生、活化產(chǎn)生膠原和非膠原性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是心肌纖維化形成的核心事件。近年來(lái)研究表明:心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast，cFb)有多個(gè)來(lái)源，除心臟原位cFb外，骨髓和心臟組織中的上皮/內(nèi)皮細(xì)胞均是 cFb的來(lái)源［2-4］，后者通過(guò)上皮/內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial/endothelial to mesenchymal transition，EMT/EndMT)可以轉(zhuǎn)變成為cFb［2，5］。心外來(lái)源的cFb與心肌纖維化的關(guān)系日益受到關(guān)注，在自身免疫性心肌炎模型中發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的 cFb約占所有 cFb的60%［3，4］;目前尚不清楚EMT/EndMT是否與病毒性心肌炎心肌纖維化有關(guān)，本文對(duì)此進(jìn)行研究和探討。

材料和方法

1 試劑和儀器

1.1 試劑 天狼星紅(Sirius red，F(xiàn)3BA，F(xiàn)luka Chemie);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor β1，TGF- β1)、Wnt1、Twist1、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏素(VE-cadherin)、上皮細(xì)胞鈣黏素(E-cadherin)、成纖維細(xì)胞特異蛋白(fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α -smooth muscle actin，α-SMA)和內(nèi)參照α-微管蛋白(α-tubulin)Ⅰ抗均購(gòu)自 Santa Cruz。Ⅱ抗購(gòu)自 Jackson。膠原前肽ELISA試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技公司。Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen。Western blotting ECL試劑盒購(gòu)自Pirece。PVDF免疫印跡轉(zhuǎn)移膜購(gòu)自Millipore。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega。聚丙烯酰胺凝膠購(gòu)自上海碧云天生物公司。

1.2 主要儀器和軟件 ABI Prism 7700序列測(cè)定儀(ABI);HRD-045-NIK尼康照相系統(tǒng)(尼康);凝膠掃描分析系統(tǒng)(Total lab)。

2 方法

2.1 建立動(dòng)物模型 雄性、6周齡、純種近系BALB/c小鼠36只(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，平均體重20-25 g，隨機(jī)分為2組:對(duì)照組(control，n=16)和病毒性心肌炎組(viral myocarditis，VMC，n=20)。對(duì)照組每周腹腔注射1次無(wú)菌病毒培養(yǎng)液(EMEM)0.1 mL;心肌炎組每周腹腔接種1次0.1 mL 109倍50%組織培養(yǎng)感染劑量(50%tissue culture infection dose，TCID50)柯薩奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3，Nancy株)，復(fù)制急、慢性病毒性心肌炎模型。7 d后從2組中隨機(jī)選取活鼠各8只處死取樣;余小鼠繼續(xù)腹腔注射和自然喂養(yǎng)直至第30 d，統(tǒng)計(jì)最后存活小鼠數(shù)。

2.2 標(biāo)本處理 在上述各組小鼠達(dá)到觀察時(shí)點(diǎn)時(shí)，隨機(jī)取心肌炎組與對(duì)照組小鼠各8只，行心臟超聲檢查心功能，然后處死小鼠。所有存活小鼠均取血并提取血清置入-20℃冰箱凍存待測(cè);心臟組織切成2塊，分別用于組織病理學(xué)檢測(cè)(10%中性甲醛PBS固定)、基因檢測(cè)(-70℃凍存)和蛋白檢測(cè)(-40℃凍存)。

2.3 組織病理學(xué)檢測(cè) 甲醛固定的標(biāo)本經(jīng)脫水、清洗后以石蠟包埋，其后制成0.4μm厚切片，常規(guī)HE染色并行Picrosirius red膠原特異染色后鏡檢。拍片后，取8個(gè)不重復(fù)視野以自動(dòng)化照相系統(tǒng)定量分析病變程度和計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。

2.4 血清學(xué)檢測(cè) 應(yīng)用ELISA檢測(cè)如下膠原前肽:III型前膠原氨基端前肽(aminoterminal propeptide of typeⅢ procollagen，PⅢNP)、I型前膠原氨基端前肽(aminoterminalpropeptide oftype Iprocollagen，PINP)和 I型前膠原羧基端前肽(carboxyterminal propeptide of type I procollagen，PICP)，以評(píng)價(jià)心臟組織中I型和Ⅲ型膠原代謝情況。操作嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要步驟包括:標(biāo)本激活、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物工作液、終止液和顯色等，最后在492 nm處測(cè)吸光度值(A值)，根據(jù)各樣品A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所測(cè)指標(biāo)的含量。

2.5 實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè) 從每組隨機(jī)選擇6份心肌標(biāo)本，以Trizol試劑提取總RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定RNA樣品在波長(zhǎng)260 nm和280 nm的紫外吸收值，計(jì)算 A260/A280確認(rèn)其純度和濃度。取2 μg總RNA應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒兩步法合成cDNA第1鏈;將所得cDNA稀釋30倍后取3 μL分別加入預(yù)先合成的前向和逆向引物各1 μL和5 μL subgreen mix組成10 μL實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)體系，RT-PCR程序?yàn)?50℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)real-time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，計(jì)算Ct值(threshold cycle)，采用比較Ct值方法以β-actin為內(nèi)參照相對(duì)定量各檢測(cè)基因的表達(dá)水平。每一實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。所有引物均委托上海生工生物公司設(shè)計(jì)和合成，見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)目標(biāo)基因所有引物序列Table 1.Primer sequences for detection of target genes

2.6 Western blotting檢測(cè) 以Trizol試劑盒抽提心肌樣品總蛋白，各取10 μL蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，印跡轉(zhuǎn)染PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的0.05%Tween-20/PBS封閉液在室溫下孵育1 h以去除非特異結(jié)合部份，封閉液中分別加入2 μL抗 TGF-β1、Wnt1、Twist1、VE-cadherin、E-cadherin、FSP-1、α-SMA和內(nèi)參照α-tubulin抗體，4℃過(guò)夜。加入3 μL第Ⅱ抗體后，用Western blotting ECL試劑盒檢測(cè)免疫復(fù)合物，照相顯影后經(jīng)Total Lab 1.11凝膠掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描并作半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 小鼠存活率與組織病理學(xué)檢查結(jié)果

除外第7 d處理的小鼠(每組8只，共16只)，第30 d，剩余小鼠中心肌炎組存活9只(9/12)，對(duì)照組8只均存活(8/8)。HE染色:第7 d，局部心臟可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞壞死，心肌纖維斷裂;第30 d，炎癥細(xì)胞數(shù)減少，纖維組織替代部分壞死心肌，心肌細(xì)胞體積增大，排列紊亂，核大深染、異形，心肌纖維基本完整。此病理改變提示急、慢性病毒性心肌炎模型成功建立并均出現(xiàn)心肌纖維化，與我們此前報(bào)道的結(jié)果一致［6］。

2 血清膠原前肽檢測(cè)結(jié)果

心肌炎組小鼠血清膠原前肽產(chǎn)生明顯增高，與CVF變化相一致，提示急、慢性心肌炎小鼠均出現(xiàn)心肌纖維化，見(jiàn)表2。

3 急性心肌炎心臟中發(fā)生EMT/EndMT

在基因和蛋白表達(dá)水平均證實(shí)急性心肌炎(第7 d)小鼠心臟中發(fā)生EMT/EndMT，特征為上皮/內(nèi)皮細(xì)胞表型標(biāo)志(E-cadherin和VE-cadherin)丟失，表達(dá)明顯下調(diào);間充質(zhì)蛋白(FSP-1和α-SMA)產(chǎn)生增多，表達(dá)顯著上調(diào)，伴誘導(dǎo)性細(xì)胞因子 TGF-β1、轉(zhuǎn)錄因子Wnt1、Twist1等表達(dá)增加，同時(shí)膠原合成增強(qiáng)(CVF和膠原前肽升高)，與心肌纖維化變化一致，見(jiàn)表2、3和圖1。

4 慢性心肌炎心肌中未再發(fā)現(xiàn)EMT和EndMT

在基因和蛋白水平均證實(shí)慢性感染(第30 d)小鼠心臟中未再發(fā)現(xiàn)EMT/EndMT，雖然 FSP-1和α-SMA 的表達(dá)仍然顯著上調(diào)，TGF-β1、Wnt1、Twist1等因子表達(dá)增加，心肌纖維化仍然明顯，但E-cadherin和VE-cadherin表達(dá)水平未見(jiàn)下調(diào)，表2、3和圖2。

表2 小鼠血清膠原前肽和心臟膠原容積分?jǐn)?shù)的比較Table 2.Comparison of serum procollagen propeptides and cardiac collagen volume fraction(CVF)in mice(±s)

表2 小鼠血清膠原前肽和心臟膠原容積分?jǐn)?shù)的比較Table 2.Comparison of serum procollagen propeptides and cardiac collagen volume fraction(CVF)in mice(±s)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs control.

Control-day 7 8 1.7 ±0.7 1.9 ±0.4 19 ±3 3.0 ±0.7 VMC-day 7 8 3.1 ±0.2＊＊ 2.7 ±0.6* 32 ±9* 18.9 ±2.0＊＊Control-day 30 8 2.0 ±0.6 1.7 ±0.5 22 ±7 2.9 ±1.2 VMC-day 30 9 1.8 ±0.5 2.8 ±0.3* 37 ±5＊＊ 17.3 ±3.4＊＊

討 論

EMT是胚胎期器官形成發(fā)育過(guò)程中的重要事件，EndMT是其特殊表現(xiàn)形式，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)EMT/EndMT參與了病理性器官纖維化，包括腎、肺、肝、腸和心肌纖維化等［2，5，7，8］。腎損傷后纖維化時(shí)腎臟 Fb有 14%-15%來(lái)自骨髓、36%經(jīng)由 EMT 而來(lái)［7，8］;在壓力超負(fù)荷和慢性移植排斥大鼠模型中發(fā)現(xiàn):27%-35%心臟Fb經(jīng)由EndMT而來(lái)［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，僅在急性病毒感染時(shí)小鼠心臟同時(shí)出現(xiàn)EMT和EndMT，伴心肌纖維化形成;慢性病毒感染時(shí)，心肌纖維化依然明顯，但未見(jiàn)EMT和EndMT伴隨。

急性病毒感染時(shí)小鼠心臟出現(xiàn)EMT和EndMT的原因考慮與心臟上皮/內(nèi)皮細(xì)胞屏障受損、細(xì)胞連接破壞有關(guān)。上皮/內(nèi)皮受損引起TGF-β1、Wnt1、Twist1等的表達(dá)上調(diào)，可以促使上皮/內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變、加速膠原的形成，有利于限制炎癥反應(yīng)、減輕組織器官損傷［8，9］，因此急性期心肌纖維化常常被認(rèn)為是有益的修復(fù)性纖維化，此時(shí)膠原的合成和降解同時(shí)增強(qiáng)，有利于使心臟炎癥局限化［6］。有人認(rèn)為急性期心肌纖維化不宜干預(yù)，但在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn):治療急性心肌炎時(shí)，控制炎癥反應(yīng)、保護(hù)心肌等措施往往也會(huì)減輕心肌纖維化，與心肌纖維化有關(guān)的心力衰竭、心律失常、心臟性猝死等并發(fā)癥的發(fā)生率均會(huì)下降［10］，從這一點(diǎn)看來(lái)似乎有又干預(yù)的必要。本研究結(jié)果給干預(yù)急性心肌炎帶來(lái)了新的思路，在治療急性心肌炎時(shí)，除采取抗感染、抗病毒、免疫抑制、抗心衰、抗心律失常等［10］之外，如果增加上皮/內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)和干細(xì)胞治療等措施，有可能進(jìn)一步改善預(yù)后和減輕纖維化，減少近期和遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生［11，12］，但其臨床有效性和安全性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

Figure 1.Cardiac EMT/EndMT proteomes expression in mice with acute viral myocarditis.A:expression of EMT/EndMT proteomes detected by Western blotting;B:relative expression ratio of EMT/EndMT proteomes between the 2 groups.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1 急性病毒性心肌炎小鼠心臟EMT/EndMT蛋白質(zhì)組的表達(dá)

Figure 2.Cardiac EMT/EndMT proteomes expression in mice with chronic viral myocarditis.A:expression of EMT/EndMT proteomes detected by Western blotting;B:relative expression ratio of EMT/EndMT proteomes between the 2 groups.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖2 慢性病毒性心肌炎小鼠心臟中EMT/EndMT蛋白質(zhì)組的表達(dá)

表3 急、慢性期2組小鼠EMT/EndMT相關(guān)基因表達(dá)水平的比較Table 3.Comparison of relative mRNA expression levels of EMT/EndMT-related genes between the 2 groups of mice in acute and chronic stage(±s.n=6)

表3 急、慢性期2組小鼠EMT/EndMT相關(guān)基因表達(dá)水平的比較Table 3.Comparison of relative mRNA expression levels of EMT/EndMT-related genes between the 2 groups of mice in acute and chronic stage(±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

Group VE-cadherin E-cadherin TGF-β1 Wnt1 Twist1 FSP-1 α-SMA Control-day 7 8.3 ±1.2 9.5 ±1.7 4.5 ±0.9 4.5 ±1.1 5.2 ±1.4 6.0 ±1.1 3.7 ±0.8 VMC-day 7 4.6 ±1.1＊＊ 3.9 ±1.0＊＊ 8.9 ±1.9＊＊ 9.5 ±1.3＊＊ 12.1 ±2.1＊＊ 13.6 ±1.8＊＊ 9.6 ±1.4＊＊Control-day 30 9.2 ±1.6 10.3 ±1.5 3.8 ±1.1 3.8 ±0.8 3.1 ±0.3 3.5 ±0.7 2.6 ±0.1 VMC-day 30 10.3 ±1.9 15.5 ±2.3* 8.5 ±1.7＊＊ 9.5 ±1.9＊＊ 6.8 ±1.0＊＊ 8.0 ±1.5＊＊ 7.8 ±1.2＊＊

慢性期未出現(xiàn)EMT/EndMT可能是因?yàn)槭軗p的內(nèi)皮/上皮已經(jīng)完成自我修復(fù)更新，此時(shí)TGF-β1、Wnt1、Twist1等的活躍表達(dá)可能通過(guò)影響心臟原位的或骨髓來(lái)源cFb的活動(dòng)而促進(jìn)心肌纖維化形成［8，10，11］。這一結(jié)果一方面說(shuō)明慢性心肌炎心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制與急性期有很大差異，另一方面提示對(duì)慢性期心肌纖維化的干預(yù)要尋找新的切入點(diǎn)。干預(yù)慢性心肌炎心肌纖維化時(shí)除了針對(duì)TGF-β1和Wnt1的刺激因素如病原體、神經(jīng)體液因子、機(jī)械牽拉等［9］之外，還可以考慮采取措施直接抑制或拮抗TGF-β1和Wnt1，以及針對(duì) TGF-β1/Smad通路和Wnt1/β-catenin信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子進(jìn)行干預(yù)。TGF-β1和Wnt1均是促纖維化的重要信號(hào)分子，TGF-β1可以調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和產(chǎn)膠原細(xì)胞的交互作用，在多種器官纖維化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，抑制 TGF-β1可以明顯改善器官纖維化［9，13］;TGF- β1/Smad 和 Wnt1/β -catenin 兩大信號(hào)通路系統(tǒng)在肺纖維化時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有協(xié)同作用［14］。據(jù)此推測(cè)在我們的心肌炎模型中TGF-β1/Smad和Wnt1/β-catenin兩大信號(hào)通路系統(tǒng)的關(guān)鍵因子TGF-β1和Wnt1同時(shí)上調(diào)也可能是一種協(xié)同效應(yīng)，因此，采用針對(duì)這兩大信號(hào)通路的干預(yù)很可能可以抑制或延緩心肌纖維化進(jìn)程;但由于這些信號(hào)分子往往具有多種功能，針對(duì)它們的干預(yù)在實(shí)際操作時(shí)需要慎重考慮，以免引起不良后果。

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