劉新雄

兩種凍融方法對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞冷凍效果的研究

劉新雄

目的 探討不同冷凍方法對(duì)成熟期(MⅡ)卵母細(xì)胞體外受精及胚胎發(fā)育能力的影響。方法 收集昆明小鼠 MⅡ期卵母細(xì)胞,分別行玻璃化冷凍與程序化冷凍。解凍后比較兩組復(fù)活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。結(jié)果 玻璃化冷凍法冷凍 MⅡ期卵母細(xì)胞解凍后存活率顯著高于程序化冷凍組的(80.1%vs.55.5%,P＜0.01),并且兩組的囊胚形成率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(28.6%vs.19.4%,P＜0.05)。結(jié)論 在進(jìn)行卵母細(xì)胞冷凍保存時(shí),玻璃化冷凍法冷凍效果好于程序冷凍法。

小鼠;卵母細(xì)胞;玻璃化冷凍;胚胎發(fā)育

卵母細(xì)胞凍存是輔助生育領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,冷凍技術(shù)主要有程序化冷凍及玻璃化冷凍法。近年來(lái)由于冷凍技術(shù)和方法的改進(jìn),特別是玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展,凍融卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率和受精率均有所提高,然而由于卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性,卵母細(xì)胞冷凍保存效果尚不理想[1,2]。本研究以小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞為模型,應(yīng)用程序化冷凍法與玻璃化冷凍法分別冷凍小鼠成熟期(metaphageⅡ,MⅡ)卵母細(xì)胞,比較兩組卵母細(xì)胞解凍后的發(fā)育潛能,旨在為人卵母細(xì)胞的冷凍保存提供參考依據(jù)與理論。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心昆明小鼠 30只,體質(zhì)量為 25～35 g,飼養(yǎng)條件為光照 14 h,黑暗 10h,小鼠可自由飲水、進(jìn)食。

1.2 收集卵母細(xì)胞 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,于雌鼠腹腔內(nèi)注射人絕經(jīng)期尿促性腺激素(HMG)10 IU,48 h后注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 IU,16～18h后頸椎脫臼法處死小鼠,收集有顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞并將其置于 80 IU/ml的透明質(zhì)酸酶中,收集并選擇形態(tài)正常、有第一極體的卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍。

1.3 卵母細(xì)胞的冷凍與解凍 將收集的MⅡ期卵母細(xì)胞分別行程序化冷凍和玻璃化冷凍。程序化冷凍方法:冷凍和解凍均按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。玻璃化冷凍方法:冷凍:先將卵子在 PBS+15%胎牛血清(FCS)溶液中沖洗 2～3次,再移入10%乙二醇(EG)+10%二甲基亞砜(DMSO)溶液中停留30s,然后移入 20%EG+20%DMSO+0.5mol/L蔗糖溶液中,用 OPS管通過虹吸作用將卵吸入管中,投入液氮。解凍:依次將卵子移入含 0.5mol/L、0.25mol/L、0.1mol/L的蔗糖溶液中,各停留 3min。再移到培養(yǎng)液中沖洗3～4次,然后將細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)正常、透明帶完整、周圍間隙小的卵母細(xì)胞移入培養(yǎng)液中,放入 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 體外受精及培養(yǎng) 在受精當(dāng)天,選用性成熟的成年雄性昆明小鼠,頸椎脫臼處死后,刺破附睪尾部,獲得的精液懸浮液置 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1～2h獲能后,以 5×106/ml的終濃度進(jìn)行授精。6～9 h后顯微鏡下鏡檢,觀察受精情況(見第二極體或雙原核的卵判為已受精),將受精卵移入卵裂培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中,置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察受精卵的發(fā)育情況并記錄。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

解凍后,采用玻璃化冷凍法冷凍的 MⅡ期卵母細(xì)胞復(fù)活率為 80.1%,顯著高于程序冷凍法組的 55.5%(P＜0.01)。解凍后卵母細(xì)胞的囊胚形成率分別為 28.6%和 19.4%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組受精率、卵裂率相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表 1。

表 1 兩種冷凍方法對(duì)小鼠成熟期卵母細(xì)胞冷凍效果的影響(例,%)

3 討論

卵母細(xì)胞冷凍是輔助生育技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。1986年全世界第一例通過凍存卵母細(xì)胞獲得試管嬰兒成功降生,然而由于卵母細(xì)胞體積大、細(xì)胞膜與細(xì)胞漿比例小等自身生物學(xué)特點(diǎn)[3],卵母細(xì)胞冷凍發(fā)展較慢,目前臨床上尚未廣泛應(yīng)用,僅局限于實(shí)驗(yàn)研究。卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)主要有程序冷凍與玻璃化冷凍。程序化冷凍法是將胚胎放置在一定濃度的冷凍保護(hù)液內(nèi),程序冷凍儀運(yùn)行預(yù)設(shè)的程序緩慢降溫使細(xì)胞逐步實(shí)現(xiàn)脫水,當(dāng)達(dá)到預(yù)設(shè)定溫度后快速投入液氮而達(dá)到冷凍保存的目的。程序化慢速冷凍法是一種有效的方法,但無(wú)法避免凍融過程中冰晶形成對(duì)胚胎的損傷。玻璃化冷凍是一種快速冷凍技術(shù),可使細(xì)胞迅速通過“危險(xiǎn)溫度區(qū)”,降低細(xì)胞對(duì)低溫的敏感性,使其從液態(tài)直接變?yōu)闊o(wú)結(jié)構(gòu)的玻璃狀態(tài),從而保持溶液狀態(tài)的分子和離子分布,避免冰晶的形成,減少了細(xì)胞的機(jī)械性損傷,使細(xì)胞得以在降溫過程中保持結(jié)構(gòu)的完整。

本研究分別采用程序化冷凍法和玻璃化冷凍法保存小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞,結(jié)果顯示,玻璃化冷凍法冷凍組的卵母細(xì)胞復(fù)活率達(dá) 80.1%,而程序化冷凍法的復(fù)活率只有 55.5%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。玻璃化冷凍法組的囊胚率達(dá)到了 28.6%,顯著高于程序冷凍法組的 19.4%(P＜0.05)。這可能是因?yàn)椴ＡЩ夹g(shù)的快速降溫,使卵母細(xì)胞快速越過冰晶形成溫區(qū)(5℃～15℃)之間,這樣避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成,盡可能地減小冰晶對(duì)透明帶及細(xì)胞骨架的損傷,說(shuō)明玻璃化技術(shù)比傳統(tǒng)程序冷凍法能更好地保護(hù)卵母細(xì)胞,與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[4,5]。

總之,從以上結(jié)果可看出玻璃化冷凍小鼠卵母細(xì)胞的效果明顯優(yōu)于程序冷凍法,說(shuō)明玻璃化冷凍法的冷凍效果比程序冷凍法好。這可能與玻璃化技術(shù)快速降溫避免了冰晶對(duì)卵母細(xì)胞的損傷等有關(guān)。因此,玻璃化技術(shù)是一種有效、簡(jiǎn)便、安全的低溫冷凍技術(shù)。隨著低毒性的玻璃化液被發(fā)現(xiàn)與運(yùn)用,凍融后卵母細(xì)胞的復(fù)活率、受精率、卵裂率及囊胚率的提高,玻璃化技術(shù)將成為卵母細(xì)胞凍存的主要方法。

[1] Kim TJ,Laufer LR,Hong SM,et al.Vitrification of oocytesproduces high pregnancy rates when carried out in fertilewoman.FertilSteril,2010,93:467-474.

[2] 廖宏慶,林戈,陸長(zhǎng)富,等.不成熟卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)及玻璃化冷凍.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(11):1614-1617.

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[5] Liebermann J,Tucker MJ.Sills ES.Cryoloop vitrification in assisted reproduction:analysis of survival rates in 1000 human oocytes after ultra-rapid cooling with polymer augmented cryoprotectants.ClinExpObstetGynecol,2003,30(23):125-129.

Study of the effect of different methods for mature oocytes cryopreservation in rats

LIU Xin-xiong.Qinzhou Maternal and Child Health Hospital Fertility Center,Guangxi53500,China

Objective To explore the effect of differentmethodson in vitro fertilization(IVF)and embryonic developmental capacity of thawedmetaphageⅡ(MⅡ)stage oocytes.Methods The oocytes on MⅡstage were collected,then were cryopreserved by programmed cryopreservation and vitrification cryopreservation.The thawed oocyteswere cultured to observe the rates of survival,IVF,cleavage and bastocyst.Results The survival rate ofoocytesby vitrification cryopreservation was significantly higher than those by programmed cryopreservation(80.1%vs.55.5%,P＜0.01).Therewasalso significantdifference in the ratesofbastocyst in differentgroups(28.6%vs.19.4%,P＜0.05).Conclusion Vitrification cryopreservation ismore effective in oocytes cryopreservation on MⅡstage.

Mouse;Oocytes;Vitrification;Embryonic development

535000廣西欽州市婦幼保健院生殖中心