許世福，呂黃偉

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧沈陽 110001

異氟烷是臨床上常用的吸入麻醉藥之一，在近代神經(jīng)外科手術(shù)中應(yīng)用日益廣泛。但其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響非常復(fù)雜。異氟烷除用于腦科手術(shù)的麻醉外，也用于控制性降壓。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，僅有少數(shù)觀測了術(shù)后腦功能情況[1]。但對(duì)于異氟烷麻醉所致學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)神經(jīng)功能生化物質(zhì)變化和學(xué)習(xí)記憶能力缺乏評(píng)價(jià)。因此筆者選擇觀察大鼠海馬內(nèi)S-100β免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞表達(dá)、Y-型電迷宮作為學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)，研究異氟烷麻醉對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 篩選

選取雄性14月齡SD大鼠，體重325～375 g。①將大鼠放入Y型電迷宮箱中，選擇活躍，對(duì)電擊反應(yīng)較敏感，逃避反應(yīng)迅速者供測試用。淘汰反應(yīng)過于遲鈍或特別敏感的大鼠。②預(yù)選出達(dá)到連續(xù)2次正確反應(yīng)、電擊次數(shù)≤3次，對(duì)電擊反應(yīng)較敏感的大鼠供實(shí)驗(yàn)用[2-3]。③在上述初步篩選的基礎(chǔ)上，通過正式迷宮訓(xùn)練，淘汰達(dá)不到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（以連續(xù)20次測試中有18次或以上、正確反應(yīng)率≥90%為達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[4]）的大鼠。

1.1.2 分組

篩選學(xué)習(xí)記憶功能正常的雄性SD大鼠32只。隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）和異氟烷組（B組），每組16只，分四個(gè)時(shí)間點(diǎn)：麻醉后即刻（對(duì)照組為麻醉前）、麻醉后第1、3、7天，各取4只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法

①A組：水合氯醛麻醉后不做降壓處理，采用5%葡萄糖注射液連續(xù)泵注，最高泵速不超過3.5 ml/h。②B組：5%葡萄糖連續(xù)泵注，最高泵速不超過3.5 ml/h。1%~1.5%異氟烷吸入麻醉，血壓維持在大鼠正常生理范圍。③于行10%水合氯醛（按3.5 ml/kg劑量）腹腔注射麻醉后，套管針氣管插管，動(dòng)物呼吸機(jī)控制呼吸，Deatex-Ohmeda氣體監(jiān)測儀分析氣體濃度，使用BP-6動(dòng)物無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀，監(jiān)測大鼠尾動(dòng)脈血壓，待血壓穩(wěn)定20 min后開始降壓。以4.5號(hào)頭皮針大鼠尾靜脈穿刺，連接靜脈輸液泵。采用白熾燈直接照射大鼠，保持肛溫（37.0±0.5）℃ 。B 組麻醉持續(xù) 4 h。 麻醉后第 1、3、7 天利用 Y迷宮進(jìn)行認(rèn)知功能的測定。

1.2.2 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的Y-型電迷宮測試及觀察指標(biāo)

將大鼠放入Y-型電迷宮箱中，讓其適應(yīng)5 min，采用“固定次數(shù)隨機(jī)法”測試30次。記錄正確反應(yīng)率（right number，RN）和全天總反應(yīng)時(shí)間（total reaction time，TRT）。測試均每天上午的固定時(shí)間進(jìn)行，專人負(fù)責(zé)進(jìn)行，并且采取單盲方法，盡量減少了測試中參數(shù)判斷上的人為誤差。

1.2.3 海馬HE染色和S-100β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

1.2.3.1 標(biāo)本的石蠟包埋和HE染色 Y-型電迷宮測試后，用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定，剪開胸腔暴露心臟，先快速灌注生理鹽水200 ml，換為4℃4%多聚甲醛300 ml，至大鼠呈僵直狀態(tài)。然后斷頭取腦，分離海馬，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h；大鼠海馬以PBS溶液沖洗標(biāo)本3次，浸泡過夜；經(jīng)上行梯度酒精脫水；將標(biāo)本浸泡透明劑二甲苯溶液中透明，共兩次；將已透明的組織塊置于已融化的石蠟中進(jìn)行包埋。在切片機(jī)上冠狀切取海馬5 μm厚的連續(xù)切片，行HE染色。

1.2.3.2 免疫組化染色（SABC法）脫蠟前組織切片兩次二甲苯脫蠟，經(jīng)下行梯度酒精水化，無水酒精、各濃度酒精水化后均PBS洗2次；用PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5~10min，用蒸餾水洗3次；抗原修復(fù)后滴加正常山羊血清封閉液，室溫 20 min，甩去多余液體；滴加Ⅰ抗（S-100β 1∶200）50 μl,室溫靜置1 h；PBS洗3次，滴加生物素化Ⅱ抗（山羊抗小鼠IgG 1∶400），37℃孵育 20 min，PBS 洗 3 次； 滴加試劑 SABC 37℃孵育 20 min，PBS洗 4次；DAB 顯色：取 1 ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。蘇木素輕度復(fù)染（鏡下掌握顯色程度）。脫水、透明、封片，各步間PBS洗3次。胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)。在低倍鏡（40×、100×）下在腦海馬內(nèi)尋找陽性表達(dá)細(xì)胞，并在高倍鏡（200×）下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，每只大鼠計(jì)數(shù)5張切片，用陽性細(xì)胞平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P﹤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠Y-型電迷宮測試結(jié)果

兩組大鼠Y-型電迷宮測試結(jié)果顯示，麻醉前大鼠生理指標(biāo)和學(xué)習(xí)記憶功能組間差異無顯著性。①麻醉后第1天正確反應(yīng)次數(shù)B組＜A組，全天總反應(yīng)時(shí)間B組>A組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。麻醉后第3、7天四組間正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠Y-型電迷宮測試結(jié)果比較 （ ±s，n=32）

表1 兩組大鼠Y-型電迷宮測試結(jié)果比較 （ ±s，n=32）

A組B組組別 項(xiàng)目 麻醉前正確反應(yīng)次數(shù)全天總反應(yīng)時(shí)間（s）正確反應(yīng)次數(shù)全天總反應(yīng)時(shí)間（s）12.31±1.68 61.46±1.48 11.83±2.44 62.48±2.29麻醉后1 d 13.64±2.76 68.42±3.27 12.43±3.29 74.83±4.37麻醉后3 d 17.54±1.67 59.42±2.45 16.23±2.18 60.56±4.25麻醉后7 d 22.68±2.02 58.22±3.65 21.54±1.88 58.42±2.62

2.2 兩組大鼠腦海馬組織HE染色結(jié)果的比較

HE染色結(jié)果比較：麻醉后即刻、麻醉后1 d B組觀察海馬CAI區(qū)神經(jīng)元數(shù)日較少，細(xì)胞排列欠規(guī)則，見少量錐體細(xì)胞壞死；A組海馬CAI區(qū)未見明顯錐體細(xì)胞壞死，細(xì)胞排列基本規(guī)則，神經(jīng)元密度較均勻（圖1）。麻醉后第3、7天兩組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元數(shù)目及錐體細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。

2.3 兩組大鼠腦海馬組織S-100β免疫組化染色和計(jì)數(shù)的比較

麻醉后即刻、麻醉后第1天 B組S-100β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)高于A組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；麻醉后第3、7天兩組Aβ抗體及S-100β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

3 討論

大鼠作為常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，大鼠的腦組織結(jié)構(gòu)與靈長類有類似之處，是本實(shí)驗(yàn)的理想實(shí)驗(yàn)物種。海馬與記憶有著密切的聯(lián)系，海馬通過腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)系統(tǒng)及皮質(zhì)下行纖維接受來自視、聽、觸、痛等多種感覺信息，并參與調(diào)節(jié)內(nèi)分泌活動(dòng)，因?yàn)檫@樣海馬是被研究最早和最多的與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)[5]。研究己經(jīng)證實(shí)大鼠記憶保持能力與海馬CAI區(qū)突觸結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[6]。所以在本實(shí)驗(yàn)中，筆者以海馬組織為形態(tài)學(xué)研究對(duì)象，行海馬組織HE染色和S-100β免疫組化染色觀察。

S-100蛋白是一組低分子量的鈣結(jié)合蛋白，包含α、β兩種同分異構(gòu)的亞單位，即S-100α和S-100β，特異性地存在中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是神經(jīng)膠質(zhì)的標(biāo)記蛋白。S-100蛋白與AD的發(fā)展密切相關(guān)，低濃度神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)作用，高濃度可引起神經(jīng)元變性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-6]。

異氟烷是臨床常用吸入性麻醉藥。對(duì)于異氟烷引起認(rèn)知功能障礙發(fā)生的具體機(jī)制的研究并不十分全面。Culley等[7]通過動(dòng)物行為學(xué)觀察研究了異氟烷對(duì)老齡大鼠認(rèn)知功能的影響，發(fā)現(xiàn)老齡大鼠吸入異氟烷后，老齡大鼠的空間記憶功能損害可持續(xù)兩周左右，而接受同樣麻醉的低齡大鼠學(xué)習(xí)記憶能力沒有下降，反而有增強(qiáng)現(xiàn)象。但Alkire等[8]認(rèn)為即使低濃度的異氟烷也可能會(huì)干擾老齡大鼠全身麻醉后記憶能力，而且沒有出現(xiàn)記憶功能增強(qiáng)的作用。本實(shí)驗(yàn)同樣是采用Y-型電迷宮對(duì)老齡大鼠異氟烷吸入全身麻醉后行行為學(xué)觀察，從麻醉后行為學(xué)觀察來看，吸入1.0%～1.5%異氟烷維持4 h麻醉后正確反應(yīng)次數(shù)、全天總反應(yīng)時(shí)間均降低，說明大鼠空間記憶受到損害，但是損害程度較輕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述學(xué)者研究結(jié)果的差異可能主要與大鼠的具體年齡、吸入麻醉藥物濃度及其持續(xù)時(shí)間以及樣本量等有關(guān)。1.0%～1.5%異氟烷維持4 h S-100β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)輕度高于對(duì)照組，說明臨床相關(guān)劑量異氟烷可引起S-100蛋白濃度增加，術(shù)后未出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能降低，可以推測吸入1.0%～1.5%異氟烷維持4 h對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶影響不明顯。

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