張玉碧 ，呂林華 ，呂立華

1.湖南省邵陽市中心醫(yī)院血液腫瘤科，湖南邵陽 422000；2.中山大學(xué)附一院，廣東廣州 510080；3.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，湖南邵陽 422000

大蒜素是從大蒜球莖中提取的含硫化合物，具有強(qiáng)大的抗炎作用[1]，近年研究發(fā)現(xiàn)大蒜素具有防癌、抗癌的特點(diǎn)[2]。索拉菲尼（Sorafenib）是一種口服的多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑，臨床治療肝癌療效確切，是目前晚期肝細(xì)胞肝癌（HCC）的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物。我們通過大蒜素聯(lián)合索拉菲尼對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖作用的影響，以期從大蒜素聯(lián)合索拉菲尼對Bcl-2基因mRNA的影響來研究其抗腫瘤作用機(jī)制，為中藥治療肝癌尋找新的突破方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器

ELX808酶標(biāo)儀，美國Bio Tek公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞與試劑

HepG2細(xì)胞株；DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone）；小牛血清（杭州四季青公司）；二甲基亞楓（DMSO）；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT美國 Sigma)；大蒜素 （邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，0.5 mol/ml，乙醇法提?。骼颇幔ǖ聡荻荆?。BCL-2基因引物由寶泰克生物技術(shù)公司合成；RT-PCR kit（寶生公司）；PCR擴(kuò)增儀 （Minicvcler M7 Research）。

1.3 方法與結(jié)果

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含量10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)條件：37℃、100%濕度、5%CO2、95%空氣。每24 h換液1次。

1.3.2 MTT法檢測HepG2細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長的HepG2細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入藥物。 實(shí)驗(yàn)分組：大蒜素（2、4、8、16、32 mg/L）、大蒜素 8 mg/L+索拉非尼（8 μmol/L）聯(lián)合用藥組，另設(shè)不加藥的對照組，作用于HepG2細(xì)胞。每個(gè)劑量設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加藥后分別培養(yǎng)24、48、72h 后每孔加入 MTT（5 mg/m1）10 L，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加 150 μl DMSO，振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀（波長570 nm）測定各孔的OD值，計(jì)算各組藥物對細(xì)胞增殖抑制率，抑制率（%）=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.3.3 RT-PCR檢測Bcl-2基因mRNA表達(dá) 取培養(yǎng)24 h后的HepG2細(xì)胞，以Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增按RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行，PCR擴(kuò)增體系為50 μl。Bcl-2、GAPDH的引物由寶泰克生物技術(shù)公司合成。Bcl-2 mRNA探 針 序 列 ：5＇-GGAGCGTCAACAGGGGATTG-3＇，5＇-GATGC CGGTC AGGTA CTCAG-3＇上游引物和下游引物務(wù)2 μl，Taq酶 2 U，與逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA混勻，瞬時(shí)離心；擴(kuò)增條件：94℃ 2 min、92℃ 1 min、55℃ 45 s、72℃ 1 min。 GAPDH 的引物序列：5＇-ATCAC TGCCA CTCAG GAGTC-3＇，5＇-TGAGG GAGAT GCTCA GTGTT-3＇。GAPDH 的擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，94℃ 1 min，55℃ l min,74℃ l min，25 個(gè)循環(huán)，74℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素聯(lián)合索拉菲尼對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響

加入大蒜素聯(lián)合索拉菲尼后，與對照組相比，肝癌細(xì)胞存活率下降，不同濃度大蒜素對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)，見表1、圖1。

表1 MTT法檢測不同濃度大蒜素聯(lián)合索拉菲尼對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用（OD值，n=6）

2.2 大蒜素聯(lián)合索拉菲尼對Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

通過RT-PCR法檢測HepG2細(xì)胞HepG2細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)，HepG2細(xì)胞經(jīng)大蒜素、索拉菲尼、大蒜素聯(lián)合索拉菲尼作用后，以Trizol法提取總RNA，通過RT-PCR后，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，Bcl-2基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度為304bp，GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度為260bp。見圖2。

3 討論

原發(fā)性肝癌在我國發(fā)病率、死亡率都非常高，嚴(yán)重威脅了人民的健康和生命。索拉菲尼是目前治療晚期HCC的公認(rèn)的最有效的藥物。大蒜素作為大蒜的主要有效成分，大蒜素對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用[3]，近年來成為抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。索拉菲尼為首個(gè)獲準(zhǔn)上市的多靶點(diǎn)靶向治療藥物，是一種新型多靶點(diǎn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑[4]，能誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞癌形成過程中巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的聚集[5]。索拉菲尼對體外人肝癌HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，主要表現(xiàn)為抑制其增殖和促進(jìn)其凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)研究大蒜素聯(lián)合索拉菲尼對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和Bcl-2基因的mRNA表達(dá)，觀察不同時(shí)間的作用結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)通過MTT法發(fā)現(xiàn)，大蒜素在濃度2~32 mg/L范圍內(nèi)對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系 （P＜0.05)。另外，大蒜素聯(lián)合索拉菲尼降低了人肝癌HepG2細(xì)胞存活數(shù)目，表明大蒜素聯(lián)合索拉菲尼對人肝癌細(xì)胞的增殖有抑制作用。

現(xiàn)代研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡所致，促凋亡基因活性受抑制和抗凋亡基因被激活是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡被抑制而長期存活的主要原因[7]。Bcl-2基因是一種重要的抑制細(xì)胞凋亡的基因，廣泛存在于各種腫瘤細(xì)胞中，抑制Bcl-2基因的表達(dá)可使眾多種類的癌細(xì)胞進(jìn)入凋亡，Bcl-2基因的高表達(dá)嚴(yán)重影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并使腫瘤細(xì)胞對放療和化療產(chǎn)生抵抗。在肝癌、膀胱癌等癌癥中均證實(shí)Bcl-2基因的過度表達(dá)提示患者預(yù)后差[8]。Bcl-2可導(dǎo)致DNA受損的細(xì)胞持續(xù)生存、突變產(chǎn)物聚集，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]，shRNA可致HepG-2細(xì)胞凋亡，并抑制Bcl-2的表達(dá)[10]。

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明大蒜素聯(lián)合索拉菲尼作用24 h后Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平隨藥物濃度降低而上升，提示能下調(diào)HepG2細(xì)胞Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平，這可能是其誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，其詳細(xì)作用機(jī)制還需深入研究。

綜上所述，大蒜素聯(lián)合索拉菲尼對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，對Bcl-2 mRNA表達(dá)的下調(diào)作用機(jī)制的闡明為肝癌治療開辟了新的途徑，值得臨床廣泛推廣。

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