【作 者】楊杰，令狐恩強，王銀川

1 解放軍總醫(yī)院消化疾病中心 ，北京 ，100853

2 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京，100871

銀，作為傳統(tǒng)的抗菌材料，在古代就被廣泛用于抗菌、防腐,具有強大的抑菌、殺菌作用及廣譜的抗菌活性。納米銀作為金屬銀的一種特殊形態(tài),是指粒徑在1-100 nm之間的金屬銀微粒組成的粉體。由于納米銀顆粒極其微小,表面積較大,使其具有顯著的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和量子隧道效應(yīng), 因而具有與傳統(tǒng)無機抗菌劑無法比擬的抗菌效果,且安全性高、效力持久[1-2]。納米銀粉可裝載于活性碳纖維、紡織品、涂料等產(chǎn)品中，制備出具有抗菌功能的產(chǎn)品。在在衛(wèi)生、保健、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用[3-5]。

膽管塑料支架可更換且價格便宜, 適用于良性狹窄及膽漏治療。但膽管支架置入膽管后，支架的末端位于十二指腸腔內(nèi)，oddis括約肌失去功能，膽管壓力降低使十二指腸內(nèi)容物返流，十二指腸腔內(nèi)的細(xì)菌返流進入膽管，潛在增加膽系感染及引起支架阻塞[6]。使用目前材料制作的支架及附件均無抗菌作用。膽管納米銀涂層塑料支架的應(yīng)用未見相關(guān)報道。

1 膽管塑料支架納米銀涂層制備原理及步驟

以直徑8.5 Fr，長5 cm國產(chǎn)普通聚四氟乙烯材料制成的塑料膽管支架為載體，采用化學(xué)氧化還原法，利用超聲波振蕩及磁力攪拌等方法，以硝酸銀為原料，將納米銀顆粒還原并沉積在載體材料表面，使支架內(nèi)外表面均勻附著納米銀顆粒。納米銀涂層支架制作流程如圖1所示。

圖 1 鍍納米銀工藝流程Fig. 1 Technological process of nano-silver plating

(1) 除油

將膽管聚四氟乙烯支架浸于無水乙醇中振蕩超聲清洗。

(2) 粗化（還原）

粗化液配制：將一定量的金屬鈉加入到四氫呋喃與萘的溶液。磁力攪拌器室溫下攪拌，直至溶液顏色呈現(xiàn)深褐色或黑色。

金屬鈉為強還原劑，空氣中易燃燒。因此以萘為分散劑，通過磁力攪拌器攪拌將鈉均勻溶于有機溶劑四氫呋喃中, 將除油后塑料支架放入粗化液中腐蝕(通過還原法)粗化4小時，目的是除去支架表面的部分氟原子，在表面形成部分碳化層和某些極性基團。

(3) 清洗

首先，用二次去離子水充分清洗，以除去支架表面吸附的鈉和大部分萘、四氫呋喃（2Na+H2O→2NaOH+H2↑）；然后，用乙醇浸泡超聲清洗支架進一步除去多余的萘、四氫呋喃。

(4) 粗化（氧化）

將清洗后的塑料支架室溫下放入稀硝酸溶液中進行氧化。稀硝酸為強氧化劑，使支架表面引入羥基、羰基和不飽和鍵等極性基團，這些基團能使表面能增大，接觸角變小，潤濕性提高，由憎水性變?yōu)橛H水性，并在其表面形成適當(dāng)?shù)拇植诙龋员ＷC銀沉積層具有良好的附著力。一般來說，溫度高，粗化效果好。但溫度過高，塑料制品容易變形，所以，粗化溫度要受到塑料制品熱變形溫度的限制。

(5) 清洗

二次去離子水充分清洗膽管塑料支架。

(6) 敏化

敏化液配制：取適量SnCl2.2H20及Sn粒加入二次去離子水配成SnCl2水溶液。將清洗后膽管塑料支架迅速放入敏化液中。目的是支架表面吸附有還原劑Sn2+。因為+2價Sn不穩(wěn)定，有明顯的還原性。Sn+2在空氣中也容易被氧化為Sn4+。

(7) 鍍銀（活化）

將敏化后膽管塑料支架迅速浸入銀氨水（緩沖）溶液（氨水+AgNO3水溶液）的活化液中，恒溫水浴鍋中保溫。發(fā)生如下反應(yīng)：Sn+2++2Ag+=Sn+4+2Ag↓，還原劑Sn+2將金屬銀還原成金屬，吸附于制品表面形成納米銀涂層。膽管支架內(nèi)外壁均勻附著納米銀，呈黑色見圖2。

(8) 清洗

將沉積納米銀涂層后的膽管支架用二次去離子水充分清洗。鍍納米銀前后的聚四氟乙烯支架如圖2所示。

圖2 膽管支架Fig.2 Biliary tract prosthesis

2 納米銀涂層與性能檢測

2.1 透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscopy TEM H-9000型 日本日立公司）觀察制備的納米銀涂層顆粒大小為5-80nm，見圖3。

圖3 制備納米銀納米顆粒Fig.3 Nanoparticle of preparative nano-silver

2.2 通過掃描隧道顯微鏡（Scanning Tunneling Microscopy STM IIIA美國DI公司）觀察，在銀氨溶液濃度一定時，納米銀銀涂層厚度隨銀氨溶液用量增加而增加。30 ml銀氨溶液制得納米銀涂層厚約1 μm；60 ml銀氨制得納米銀涂層厚約5 μm，見圖4。

圖4 不同厚度納米銀涂層Fig.4 Nano-silver coating of different thickness

2.3 X射線能譜分析(Energy Dispersive X-ray analysis，EDXA)

利用TEM所帶X射線能譜儀檢測聚四氟乙烯塑料膽管支架納米銀涂層各元素的含量及其分布情況（見圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米銀涂層中僅含有Ag，未含有其他成分。至于Al的小峰，能譜儀探頭上的鋁所致，銅峰是樣品置于銅網(wǎng)檢測所致。

2.4 摩擦系數(shù)檢測

摩擦系數(shù)是指兩表面間的摩擦力和作用在其表面上的垂直力之比值。它只跟材料、接觸面粗糙程度有關(guān)，跟接觸面積無關(guān)?；瑒幽Σ料禂?shù)μ：μ= f /N，N為正壓力，f為滑動摩擦力。支架表面光滑程度決定了表面沉積的物質(zhì)數(shù)量最少。因此支架摩擦系數(shù)大小決定了支架內(nèi)腔堵塞的程度。

利用掃描隧道顯微鏡（STM）測定膽管聚四氟乙烯塑料支架及沉積不同厚度納米銀涂層后的膽管塑料支架的摩擦系數(shù)（見表1）。

圖5 納米銀涂層化學(xué)成分Fig.5 chemical composition of nano-silver coating

表1 膽管聚四氟乙烯支架及不同厚度納米銀涂層支架摩擦系數(shù)Tab.1 The friction coef fi cient of te fl on stent and stent with Nano-silver coating of different thickness

從表1可以看出，5 μm厚納米銀涂層塑料支架摩擦系數(shù)最小。所以，涂銀納米涂層后膽道支架的插入性能有了改善，同時不容易堵塞。

2.5 彈性系數(shù)檢測

楊氏模量(Young’s Modulus)：是沿縱向的彈性模量(Elastic Modulus)，也是材料力學(xué)中的名詞，是彈性材料的一種最重要、最具特征的力學(xué)性質(zhì)，是物體變形難易程度的表征。楊氏模量大小決定了支架的順應(yīng)性、安全性。

楊氏模量取決于材料的組成。楊氏模量越大，該材料的剛性越大，反之，楊氏模量越小，該材料的彈性越大

利用掃描隧道顯微鏡(STM)測定膽管聚四氟乙烯塑料支架及沉積不同厚度納米銀涂層后的膽管塑料支架的彈性系數(shù)及支架表面微觀形貌，支架表面凹凸不平的程度(高度)，見表2。

從表2可以看出，，隨著銀層厚度增加，楊氏模量最大峰值有增大趨勢，但主峰值變化并不大，說明彈性系數(shù)無巨大變化；隨著涂層厚度增加，支架表面凹凸不平程度差異變小，說明沉積納米銀涂層后支架表面更為平整，與摩擦系數(shù)檢測結(jié)果具有一致性。

2.6 抗菌試驗

表2 膽管聚四氟乙烯支架及不同厚度納米銀涂層支架彈性系數(shù)Tab.2 The elastic modulus of te fl on stent and stent with Nano-silver coating of different thickness

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株進行定性抑菌試驗，用無菌棉拭子蘸取108CFU/ml菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個MH培養(yǎng)基表面，反復(fù)3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，無菌條件下將長0.5 cm無菌膽管支架剖開，平分為2等分，無菌鑷子隨機挑取1片緊貼在平板中間，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時，實驗重復(fù)3次。納米銀涂層可見直徑達6.5±0.74 mm抑菌圈。

圖6 抑菌圈實驗Fig.6 Inhibition zone test

3 動物試驗

健康巴馬小型豬10只健用于研究。實驗用膽管支架環(huán)氧乙烷熏蒸獨立包裝。實驗動物按體重隨機分為2組.即普通膽管聚四氟乙烯支架組（n=5，普通支架組)；膽管納米銀涂層聚四氟乙烯支架組(n=5，納米銀支架組)。全麻成功后，腹腔鏡監(jiān)視下，分離并完全游離膽囊管及膽囊動脈，電凝切斷膽囊動脈 ，距膽囊管根部0.5-1.0 cm處銳性剪斷膽囊管,建立膽漏動物模型。膽漏造模術(shù)后(30分鐘-1小時)行內(nèi)鏡逆行膽管造影（ERC）及膽管塑料支架置入。術(shù)后20天處死存活動物，取出膽管支架，掃描電鏡（SEM）觀察支架內(nèi)表面菌斑情況。納米銀支架組見細(xì)菌散在分布，其間可見纖維樣物質(zhì)交聯(lián)，細(xì)菌堆積稀疏，相對疏松。SEM低倍觀察支架表面可見膜狀物附著。普通支架表面可見大量細(xì)菌粘附，細(xì)菌相互交織堆積成團，細(xì)菌數(shù)量及堆積厚度明顯增加。低倍觀察可見支架表面粗糙，膜狀物附著明顯。

4 討論

本研究通過化學(xué)還原法，以聚四氟乙烯塑料膽管支架為載體，經(jīng)過除油、化學(xué)粗化、敏化、活化、鍍銀等過程，使Ag+ 還原為Ag原子，并生長為納米銀顆粒均勻附著于支架內(nèi)外壁。

銀作為一種廣譜抗菌材料，不僅抑菌也能殺菌，而且細(xì)菌對銀離子不產(chǎn)生耐藥[7]。納米技術(shù)的出現(xiàn)，更是大大增強了銀的殺菌抗毒效力[8]。納米是一個長度單位，納米材料(nano materia1)又稱為超微顆粒材料，具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)。納米銀成黑色而不是呈銀的銀白色，就是因為隨著銀顆粒的減小，出現(xiàn)了質(zhì)子振動和能級不連續(xù)等特點，光的吸收、發(fā)射和散射發(fā)生變化而造成的。而且納米顆粒越小，顏色越深。

納米銀可發(fā)揮其表面效應(yīng)，增加金屬銀與細(xì)菌接觸的機會，通常在低濃度下即可顯示出抗菌效能，而且其抗菌性與納米粒子的總表面積有關(guān)[9]，粒徑越小，殺菌效果越好[10]。

納米銀在醫(yī)藥上的應(yīng)用成為近年來研究的熱點，新型的納銀米抗菌纖維、納米銀敷料、納米銀骨水泥、納米銀凝膠、納米銀婦科產(chǎn)品等不斷地被開發(fā)出來[11-14]。但納米銀抗菌涂層膽管支架應(yīng)用國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本實驗通過定性抗菌實驗及動物試驗，說明制備納米銀膽管支架體內(nèi)外均明顯具有抑菌、抗菌作用。

在粗化劑的選擇上我們先后試用濃硫酸，但由于氧化性太強，塑料膽管支架變型嚴(yán)重，故放棄；試用高錳酸鉀MnKO4進行氧化(粗化)后，再用SnCl2進行敏化，還原銀氨水緩沖溶液（氨水+AgNO3水溶液）中的Ag+，銀沉積效果較好 ，但考慮到錳的毒性，放棄使用高錳酸鉀；稀硝酸的氧化性比較溫和，同時活化液中的硝酸銀本身就有硝酸根離子，所以最終選擇使用稀硝酸作為粗化劑（氧化劑）。

將敏化后膽管塑料支架置入銀氨水（緩沖液）（氨水+AgNO3水溶液）中，可發(fā)生如下反應(yīng)：Sn2++2Ag+=Sn4++2Ag↓。氨水（NH3● H2O）為緩沖溶液，具有弱堿性。膽汁為弱堿性液體，因此，在弱堿性環(huán)境中制備納米銀涂層置入膽管后性能穩(wěn)定。

通過EDXA發(fā)現(xiàn)，本研究所制備納米銀涂層僅含有Ag，未含有其他化學(xué)成分，達到無毒標(biāo)準(zhǔn)，適用于動物體內(nèi)。

楊氏模量(Young’s Modulus)：是沿縱向的彈性模量(Elastic Modulus)，是彈性材料的一種最重要、最具特征的力學(xué)性質(zhì)，是物體變形難易程度的表征。應(yīng)用掃描隧道顯微鏡(TEM)檢測原始膽管塑料支架及沉積納米銀涂層后的膽管塑料支架楊氏模量(見表2)發(fā)現(xiàn)：隨著銀層厚度增加，楊氏模量最大峰值有增大趨勢，但主峰值變化并不大；大體觀察發(fā)現(xiàn)，在外力作用下支架彎曲度變大，當(dāng)外力去除后，納米銀涂層支架可完全恢復(fù)原來形狀。這種可恢復(fù)的變形稱為彈性變形。說明改性后支架彈性無明顯變化。

Coene[15]等對不同材料的支架做了廣泛的研究，認(rèn)為支架材料摩擦系數(shù)越低，支架發(fā)生堵塞的機率就越小。本實驗，我們使用TEM檢測膽管聚四氟乙烯支架及沉積納米銀涂層后的膽管塑料支架摩擦系數(shù)發(fā)現(xiàn)，沉積納米銀涂層后膽管塑料支架摩擦系數(shù)均較原始膽管塑料支架摩擦系數(shù)有變小趨勢(見表1)。提示沉積納米銀涂層后支架表面更為光滑。

圖7 支架表面菌斑Fig.7 Bacterial plaque on the surface of stent

5 結(jié)論

(1) 通過化學(xué)氧化還原法，以膽管塑料支架為載體，鈉、稀硝酸為粗化劑，四氫呋喃為溶劑，萘為分散劑，SnCl2●2H20為還原劑，硝酸銀為原料，氨水（NH3●H2O）為緩沖溶液，在弱堿性環(huán)境中成功制備在膽汁中可穩(wěn)定釋放的，支架內(nèi)外壁均均勻附著納米銀顆粒的無毒納米銀涂層塑料膽管支架。

(2) 制備納米銀涂層納米顆粒分布均勻，純度高：納米顆粒大小約5-80 nm，納米銀涂層僅含有Ag；

(3) 制備膽管納米銀涂層抗菌塑料支架表面光滑，彈性較原始支架無明顯變化。在體內(nèi)外具有較強抑菌、抗菌作用。

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