賀凌婕 張澍田 朱圣韜

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院急診科;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科,北京市消化疾病中心)

環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是細(xì)胞受到各種刺激時(shí)迅速合成的一種酶,以前被認(rèn)為是炎性反應(yīng)的一個(gè)主要標(biāo)志,近年來醫(yī)學(xué)界發(fā)現(xiàn)它參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,因此也被認(rèn)為是癌癥病情的指標(biāo)。近年來有研究[1-3]表明,在食管鱗癌和食管腺癌中都發(fā)現(xiàn)COX-2表達(dá)增加。利用RT-PCR、Western blotting、原位雜交技術(shù)等方法均證實(shí)COX-2在食管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織及正常組織[4],張強(qiáng)等[5]用原位雜交技術(shù)檢測(cè)患者食管癌組織中COX-2mRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)食管癌組織中COX-2 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為 80%,明顯高于正常食管黏膜。Takatori H等[6]對(duì)手術(shù)切除的 228例食管鱗癌組織切片用免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn) COX-2陽(yáng)性表達(dá)率為91%,且和腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期以及生存率等臨床病理特征密切相關(guān)。在食管癌中,隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的增加、鱗癌分化程度的減低,COX-2的表達(dá)亦相應(yīng)增強(qiáng)[7]。此外,COX-2在食管癌前病變中也呈過表達(dá),如鱗狀上皮發(fā)育不良和 Barrett’s食管[8-9]。Ling F C等[10]發(fā)現(xiàn),COX-2在食管炎-Barrett’s食管-食管癌的發(fā)展過程中表達(dá)逐漸增高。這些研究都表明 COX-2可能與食管癌的發(fā)病相關(guān)。為進(jìn)一步了解 COX-2的功能、作用機(jī)制和相互作用蛋白,我們擬采用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行研究,構(gòu)建誘餌載體 pG BKT7-COX-2,并轉(zhuǎn)化酵母菌 Y190,觀察其是否具有自激活作用。

1 材料和方法

1.1 材料

COX-2質(zhì)粒由美國(guó)密歇根大學(xué)的 W illiam Smith教授惠贈(zèng),酵母菌 (Saccharom yces cerevisiae)Y190、質(zhì)粒 pGBKT7、pGADT7,對(duì)照質(zhì)粒 pGBKT7-lam、pGBKT7-53、YEAST MAKER Yeast Transformation System、YEAST MAKER Yeast Plas mid Isolation kit,以及酵母菌培養(yǎng)基和 X-Gal等,均購(gòu)自 Clontech公司。DNA重組的各種限制性內(nèi)切酶及 PCR反應(yīng)系統(tǒng)的 LA Taq DNA聚合酶、dNTP、10×buffer緩沖液等購(gòu)自 TaKaRa公司。大腸桿菌 DH5α為本室保存。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1)做 PCR擴(kuò)增 COX-2質(zhì)粒：將 COX-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆作為 PCR反應(yīng)模板,用PCR的方法擴(kuò)增出目的基因。引物設(shè)計(jì)如下：COX-2 F 5′-GG A ATT CAT GCT CGC CCG CGC CCT-3′;COX-2 R 5′-CGG G AT CCC TAC AGT TCA GTC GAA CGT TCT TTTAGT AGT ACT G-3′,分別在 5′端引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和 BamHⅠ。反應(yīng)總體積為 50μL,其中包括：COX-2 F 0.5μL,COX-2 R 0.5μL,2×bufferⅠ25μL, dNTP 5μL,COX-2 1μL,LA Tag E 0.5μL,ddH2O 18 μL,反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min,94℃變性 30 s, 68℃退火30 s,72℃延伸 90 s,循環(huán)30次 ,最后72℃10 min。將獲得的 PCR產(chǎn)物電泳,切膠回收,連接 T-easy載體,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,取白色菌斑搖菌、提質(zhì)粒。質(zhì)粒測(cè)序正確后,用 EcoRⅠ和BamHⅠ酶切 COX-2-T-easy質(zhì)粒,將酶切產(chǎn)物電泳鑒定后切膠回收,保存?zhèn)溆谩?/p>

2)構(gòu)建 pGBKT7-COX-2誘餌載體：設(shè)計(jì) 20μL體系,用 EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切載體 pGBKT7,用 T4 DNA連接酶連接 pGBKT7酶切質(zhì)粒及 COX-2酶切產(chǎn)物,4℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于卡那抗性 LB瓊脂板上,倒置于 37℃恒溫箱過夜。挑取生長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆作為 PCR反應(yīng)的模板,以COX-2 F、COX-2 R作為引物,將連接產(chǎn)物菌斑做鑒定 PCR。將 PCR鑒定后的陽(yáng)性克隆菌斑搖菌、提質(zhì)粒,將所得質(zhì)粒進(jìn)行電泳鑒定及酶切鑒定。

3)制備酵母感受態(tài)：將酵母菌 Y190菌種劃線接種于 YPD平板上,30℃孵育 2～3 d后,沿劃線長(zhǎng)出白色克隆。挑取單個(gè)酵母菌菌落,接種于 5 mL YPD液體培養(yǎng)基中,充分振蕩之后加 YPD液體培養(yǎng)基至40 mL,30℃320 r/min震蕩培養(yǎng) 16～18 h。取搖菌后的酵母菌液適量,加至 10 mL YPD液體培養(yǎng)基中, 30℃320 r/min培養(yǎng) 3 h。將培養(yǎng)后的菌液 1 000 r/ min離心 5 min,棄上清,用適量 TE/LiAC溶解沉淀。再次離心、棄上清,用 TE/LiAC溶解沉淀后,再離心,取沉淀,用 TE/LiAC將沉淀懸起至 200μL,即成為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

4)將 pGBKT7-COX-2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)：將鮭精DNA加熱使之變性,取30μL變性鮭精DNA分裝于 3個(gè)微量離心管中,分別加入已構(gòu)建好的“誘餌”質(zhì)粒 pG BKT7-COX-2、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒 PG BKT7-53+ PG ADT7-T(53+T)、陰性對(duì)照質(zhì)粒 PGBKT7-lam+ PG ADT7-T(lam+T),每管中加入 100μL酵母感受態(tài)細(xì)胞,輕搖后,各加入 600μL PEG/LiAC混合液,輕柔振蕩 10 s,于 30℃,200～250 r/min振蕩培養(yǎng) 30 min。之后于每管中加入 70μL DMSO,輕柔混勻,42℃水浴熱擊 15 min,冰浴 1～2 min。14 000 r/min離心 5 min后棄上清,用 500μL ddH2O將沉淀重懸。取 100μL pG BKT7-COX-2菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷平板 SD/-Trp上,取 53+T、lam+T菌液分別涂布于 SD/-Trp/-Leu板上,倒置放入 30℃孵箱中,培養(yǎng) 1～2 d。

5)pGBKT7-COX-2自激活檢測(cè)(檢測(cè)β半乳糖苷酶活性)：待 3個(gè)平板長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆后,挑取含有陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的 Y190酵母菌落,將其印跡到無菌的濾紙上。將濾紙上菌落經(jīng)液氮凍融 3次,使菌體充分破裂。將經(jīng)液氮凍融的濾紙菌落面朝上置于被 Z buffer/X-gal浸透的另一張濾紙上,30℃放置。前2 h內(nèi)每隔 30 min觀察菌斑是否變藍(lán),之后第 4 h、第 6 h、第 8 h、第 12 h和第 24 h再次觀察菌斑顏色。

2 結(jié)果

做 PCR擴(kuò)增COX-2質(zhì)粒,將獲得的 PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳,在 1 800 bp處有一明亮的條帶,與 COX-2的大小一致(圖 1)。

COX-2質(zhì)粒測(cè)序后與www.NCB I.com網(wǎng)上 COX-2基因比對(duì),符合率為 99%(圖 2),提示 COX-2基因擴(kuò)增正確。

將測(cè)序正確的 COX-2基因與載體 pGBKT7連接,構(gòu)建誘餌載體 pGBKT7-COX-2,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞,搖菌提取質(zhì)粒,電泳鑒定,可見大小約9 100 bp左右的pG BKT7-COX-2連接產(chǎn)物(圖3)。

圖1 COX-2擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electropho resis of COX-2 amplified p roducts

用 EcoRⅠ和 BamHⅠ進(jìn)行酶切鑒定,可見 1 800 bp左右的 COX-2質(zhì)粒與 73 000 bp的 pGBKT7(圖4),鑒定正確,正確構(gòu)建了誘餌載體 pGBKT7-COX-2。

圖2 COX-2基因網(wǎng)上比對(duì)結(jié)果Fig.2 Result of the COX-2 gene online comparison

用pGBKT7-COX-2轉(zhuǎn)化酵母菌 Y190,涂布于 SD/ -Trp平板上,并將 53+T、lam+T分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)化酵母菌 Y190,涂布于 SD/-Trp/-Leu板上,30℃培養(yǎng)2 d后,可見3個(gè)平板長(zhǎng)出陽(yáng)性克隆,挑取含有陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的Y190酵母菌落,將其印跡到無菌的濾紙上。用液氮凍融 3次,使菌體充分破裂,將經(jīng)液氮凍融的濾紙菌落面朝上置于被 Z buffer/X-gal浸透的另一張濾紙上,30℃放置。觀察 24 h,可見陽(yáng)性對(duì)照 53+T菌斑顯藍(lán)色,陰性對(duì)照 lam+T及 pGBKT7-COX-2菌斑未變色(圖5)。

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng) (yeast two hybrid system)是Fields S等[11]提出并建立的一種直接于細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白-蛋白之間相互作用的遺傳學(xué)方法,其最突出的特點(diǎn)是能夠在酵母這種繁殖迅速、遺傳背景清楚且操作簡(jiǎn)便的體系中研究真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)之間的相互作用,并通過cDNA文庫(kù)的篩選可以直接找到與未知蛋白質(zhì)相互作用的 DNA序列[12];此外,利用酵母雙雜交技術(shù)可確定蛋白間的相互作用位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域。但是,由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用,酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問題是“假陽(yáng)性”。在應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行篩選 cDNA文庫(kù)之前,首先要排除“誘餌”蛋白的自激活作用,否則過多的假陽(yáng)性克隆將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,使后續(xù)的分析工作量大大增加。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了 pGBKT7-COX-2誘餌載體,并檢測(cè)了其自激活作用。結(jié)果表明,構(gòu)建的 pGBKT7-COX-2誘餌載體對(duì)報(bào)告基因 lacZ無自激活作用,為下一步篩選 cDNA文庫(kù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ),也為闡明食管鱗癌發(fā)病機(jī)制提供了線索。

[1] Z immer mann K C,SarbiaM,WeberA A,et al.Cyclooxygenase-2 expression in human esophageal carcinoma[J]. Cancer Res,1999,59：198-204.

[2] W ilson K T,Fu S,Ramanujam K S,et al.Increased expression of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in Barrett’s esophagus and associated adenocarcinomas[J].Cancer Res,1998,58：2929-2934.

[3] RistimakiA,Honkanen N,Jankala H,et al.Expression of cyclooxygenase-2 in human gastric carcinoma[J].Cancer Res,1997,57：1276-1280.

[4] Zhi H Y,WangL,Zhang J,et al.Significance of COX-2 expression in human esophageal squamous cell carcinoma [J].Carcinogenesis,2006,27：1214-1221.

[5] 張強(qiáng),穆玉恕,王宗福,等.COX-2 mRNA表達(dá)與食管癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2008,15：178-179.

[6] Takatori H,Natsugoe S,Okumura H,et al.Cyclooxygenase-2 expression is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].Eur J Surg Oncol, 2008,34：397-402.

[7] 于鐘,袁宇紅,詹俊,等.食管癌中 COX-2表達(dá)與其臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 [J].中國(guó)病理生理雜志,2006, 22：2216.

[8] KaurB S,Khamnehei N,IravaniM,et al.Rofecoxib inhibits cyclooxygenase-2 expression and activity and reduces cell proliferation in Barrett’s esophagus[J].Gastroenterology,2002,123：60-67.

[9] Shamma A,Yamamoto H,Doki Y,et al.Up-regulation of cyclooxygenase-2 in squamous carcinogenesis of the esophagus[J].Clin Cancer Res,2000,6：1229-1238.

[10]Ling F C,Baldus S E,Khochfar J,et al.Association of COX-2 expression with corresponding active and chronic inflammatory reactions inBarrett’smetaplasia and progression to cancer[J].Histopathology,2007,50：203-209.

[11]Fields S,SongO.A novel genetic system to detect proteinprotein inter-actions[J].Nature,1989,340：245-246.

[12]徐東剛,王嘉璽.酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)[J].臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),2001,22：281-282.