黃雪琨 李源 劉紅 張革化 徐偉杰

IL-1β對人鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5ACmRNA的表達(dá)的影響

黃雪琨 李源 劉紅 張革化 徐偉杰

目的探討IL-1β對鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5ACmRNA表達(dá)的影響。方法在培養(yǎng)的第二代人鼻黏膜上皮細(xì)胞加入IL-1β(10ng/ml)刺激24 h后，采用熒光定量巢式RT-PCR檢測人鼻黏膜上皮細(xì)胞中MUC5AC mRNA的定量表達(dá)。結(jié)果在培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞上檢測到MUC5ACmRNA的表達(dá)，IL-1β刺激組MUC5ACmRNA定量表達(dá)［(4.60±1.89)108拷貝/μg］均高于對照組［(2.50±1.40)107拷貝/μg］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05﹚。結(jié)論IL-1β誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞中MUC5AC mRNA的表達(dá)增高，提示IL-1β可能具有上調(diào)鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白mRNA的表達(dá)的作用。

白細(xì)胞介素1β;黏蛋白;RT-PCR

黏蛋白是鼻腔鼻竇黏液的重要組成部分，決定著黏液的粘彈性。MUC5AC是主要的分泌型黏蛋白之一，已證實(shí)MUC5AC在慢性鼻-鼻竇炎篩竇黏膜中表達(dá)增高［1］，但黏蛋白MUC5AC的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明了。白介素1β(Interleukin-1beta，IL-1β)主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種重要的具有多種功能的前炎癥細(xì)胞因子，在急性和慢性炎癥中起重要作用，在CRS的上頜竇黏膜也檢測到IL-1βmRNA表達(dá)增高［2］。本研究在培養(yǎng)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞IL-1β刺激后，采用熒光定量巢式RT-PCR檢測鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5ACmRNA表達(dá)，探討IL-1β對黏蛋白MUC5ACmRNA表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)下鼻甲黏膜組織來自我科行鼻中隔手術(shù)患者(術(shù)前已征得患者同意)，近期無應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、抗組胺及抗生素藥物史，無阿司匹林耐受不良、無哮喘病史。胎牛血清培養(yǎng)基配方、無血清培養(yǎng)基配方、鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)方法同前［3］。術(shù)中取下鼻甲黏膜組織放入胎牛血清培養(yǎng)基的無菌離心管。在無菌室超凈工作臺(tái)里，以無齒小鑷將黏膜塊夾到燒杯里，抗生素液(含100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的0.9%生理鹽水)沖洗6～7遍，5 min/次。剪碎組織，加入0.1%膠原酶(Cibco公司)，量為組織塊體積的5倍，37°消化30 min。離心1000 r/min 5 min，棄上清。沉淀中加入3 ml血清培養(yǎng)基，滴管吹打，加入培養(yǎng)瓶中，于37°5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后吸取2/3的上清液棄去，更換為無血清培養(yǎng)基。原代培養(yǎng)第3天后，倒置顯微鏡觀察，見大部分細(xì)胞貼壁，呈現(xiàn)鵝卵石隔日更換無血清培養(yǎng)基，放入37℃CO2培養(yǎng)箱。黏膜上皮細(xì)胞生長，匯合成片時(shí)則需要傳代。以吸管吸去舊的培養(yǎng)液，加無菌Hanks液洗細(xì)胞兩遍。加入0.25%胰蛋白酶約50 μl/ cm2，以恰好覆蓋細(xì)胞為宜。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮，表示細(xì)胞脫落，90%細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，輕輕吸去消化液，加入血清培養(yǎng)液，輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液，以適當(dāng)濃度種植到培養(yǎng)瓶中，置5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后更換為無血清培養(yǎng)基。

1.2 IL-1β刺激培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞取第二代培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞活性＞95%，以5×105/ml轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行無血清培養(yǎng)7～8 d后，上皮細(xì)胞接近完全融合。一組細(xì)胞加入含有IL-1β(Peprotech公司) 10ng/ml的無血清培養(yǎng)基(IL-1β刺激組，n=4)，另一組僅加入無血清培養(yǎng)基作為對照(對照組，n=4)。孵育24 h后采用熒光定量RT-PCR檢測培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC mRNA的表達(dá)。

1.3 熒光定量巢式RT-PCR

1.3.1 細(xì)胞RNA的提取直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板加TRIZol(Invitrogen公司)1 ml，溶解細(xì)胞，提取總RNA。置Eppendorf管，15℃～30℃孵育5 min，加入氯仿(0.2 ml氯仿/1 ml TRIZol)，蓋緊蓋子，用力搖動(dòng)15 s，15℃～30℃孵育2～3 min，4℃12000 r/min離心15 min，取上清液至新的Eppendorf管，加異丙醇(0.5 ml異丙醇/ml TRIzol)，15℃～30℃孵育樣品10 min，4℃12000 r/min離心10 min，棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀一次(至少1 ml 75%乙醇/ml TRIzol)，4℃7500 r/ min離心5 min，棄乙醇，空氣干燥5～10 min，加DEPC處理水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ糸L期保存，加入2.5倍體積乙醇，置-80℃保存。

1.3.2 RNA樣品鑒定利用紫外分光光度計(jì)(日本SHIMADZU UV mini 1240)上測定RNA樣品在波長為260 nm時(shí)的吸光度值(A值)?？俁NA質(zhì)量濃度計(jì)算公式:質(zhì)量濃度(g/L)=A260稀釋倍數(shù)(120倍)40/1000。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取4 μl RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，儀器為PE9600PCR儀(美國Perkin Elmer公司)。反應(yīng)體系如下: 5逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μl，上游引物(10pM/μl)0.4 μl，下游引物(10pM/μl)0.4 μl，dNTPs(25 mM)0.2 μl，MMLV(10U/μl)1 μl，DEPC水10 μl，RNA模板4 μl?？傮w積:20 μl。逆轉(zhuǎn)錄buffer成分:50 mM Tris-HCl(pH8.0)，50 mM KCl，4 mM MgCl2，10 mM DTT。反應(yīng)條件:37℃1 h，然后95℃3分鐘。

1.3.4 MUC5AC擴(kuò)增引物及熒光探針(中山大學(xué)達(dá)安基因公司)上游引物(外引物)5'-TGA CGG ACC TGG ATG TGG T-3'。下游引物(外引物)5'-TGT CAT TCC CGT AGC AGT AGG A-3'。擴(kuò)增片段180bp。上游引物(內(nèi)引物)5'-TGC GTC CCA CGA CAT CTG-3。下游引物(內(nèi)引物)5'-CAG GTG AAT GGG CAC ATG TG-3'。擴(kuò)增片段63bp。熒光探針5'-FAM-ATC GAT TGG AGA GGC CGG ACC G-TAMRA-3'。

1.3.5 檢測MUC5AC的樣本按以下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行用外引物進(jìn)行定性PCR:樣本按以下反應(yīng)體系進(jìn)行:5定性PCR buffer(美國ABI公司)5 μl，上游引物F(外) (10pM/μl)0.5 μl，下游引物R(外)(10pM/μl)0.5 μl，dNTPs (25 mM)(Sigma公司)0.4 μl，Taq酶(美國ABI公司)1.5 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 12.1 μl，總體積:25 μl。PCR buffer成分: 10 mM Tris-HCl(pH8.0)，50 mM KCl，2 mM MgCl2。.反應(yīng)條件為:93℃3 min;然后93℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，共15循環(huán);72℃5 min。用內(nèi)引物進(jìn)行熒光定量PCR:樣本按以下反應(yīng)體系進(jìn)行:5定量PCR buffer(美國ABI公司)10 μl，上游引物F(內(nèi))(10pM/μl)1 μl，下游引物R(內(nèi))(10pM/μl)1 μl，dNTPs(25 mM)(Sigma公司)0.5 μl，熒光探針(10pM/μl)1 μl，Taq酶(美國ABI公司)1.5 μl，定性產(chǎn)物5 μl，ddH2O 30 μl?？傮w積:50 μl。PCR buffer成分:10 mM Tris-HCl (pH8.0)，50 mM KCl，2 mM MgCl2。反應(yīng)條件為:93℃3 min，然后93℃45 s，55℃45 s，共40循環(huán)。熒光定量儀為PE 7000全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國Perkin Elmer公司)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)分析熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為MUC5AC的起始拷貝數(shù)及Ct值(Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。結(jié)合RNA的濃度，將熒光定量PCR結(jié)果(拷貝/μL cDNA)進(jìn)行換算，得出待測樣本MUC5AC的RNA表達(dá)量(拷貝/μg cDNA)。

2 結(jié)果

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線和熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線MUC5AC陽性標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線、熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，圖2。

圖1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品MUC5AC熒光定量標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線

圖2 MUC5AC熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞MUC5ACmRNA定量表達(dá)在培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞上檢測到MUC5ACmRNA的表達(dá)，IL-1β刺激組MUC5ACmRNA定量表達(dá)為(4.60±1.89)108拷貝/μg，對照組為(2.50±1.40)107拷貝/μg，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.423，P＜0.05﹚。

3 討論

研究表明多種因素影響呼吸道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC的表達(dá):中性白細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase)通過蛋白激酶C、活性氧族、TNF-α轉(zhuǎn)換酶的級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞過量產(chǎn)生MUC5AC［4］;IL-4通過誘導(dǎo)cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)磷酸化而上調(diào)MUC5AC基因表達(dá)［5］;神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β1(neuregulin 1bet al)通過調(diào)節(jié)原代培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞的形成，且以時(shí)間和劑量依賴方式上調(diào)MUC5AC的表達(dá)［6］;脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)增加，是通過依賴Rac1的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix met alloproteinase 9，MMP-9)分泌和活化后使NCI-H292細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)增加［7］;IL-8不僅在兩組人呼吸道衍生的細(xì)胞株(A549和NCI-H292)以時(shí)間和濃度依賴方式上調(diào)MUC5AC的表達(dá)，而且還上調(diào)正常分化的原代人支氣管上皮細(xì)胞MUC5AC的表達(dá)水平［8］。Kim等［9］在培養(yǎng)的人鼻上皮細(xì)胞中加入IL-13，結(jié)果表明IL-13對MUC5AC的表達(dá)和分泌具有抑制作用，而Zhao J等［10］研究卻發(fā)現(xiàn)IL-13通過促進(jìn)15脂肪氧化酶1(15-Lipoxygenase-1，15LO1)的活化導(dǎo)致人支氣管上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC的表達(dá)增加。

IL-1β是在局部和全身炎癥反應(yīng)中起核心作用的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子、急性時(shí)相蛋白和組織重建酶等的合成。KIM等［11］研究發(fā)現(xiàn)IL-1β以劑量依賴方式上調(diào)NCI-H292呼吸道上皮細(xì)胞MUC5AC的mRNA和蛋白表達(dá)，而Gray等［12］研究表明在高分化的人氣管支氣管黏膜上皮細(xì)胞中，IL-1β以時(shí)間和劑量依賴方式增加MUC5AC的蛋白分泌，MUC5AC的mRNA水平表達(dá)增高在IL-1β開始刺激1～4 h，4 h后MUC5AC的mRNA表達(dá)恢復(fù)正常，但MUC5AC的蛋白分泌持續(xù)增高至少72 h。Seong等［13］在培養(yǎng)的人鼻上皮細(xì)胞中加入炎癥介質(zhì)混合物(TNF-α、IL-1β、IL-4、LPS和PAF)，發(fā)現(xiàn)MUC5AC的mRNA表達(dá)下調(diào);本研究結(jié)果卻表明IL-1β刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞24 h后，MUC5AC的mRNA表達(dá)增高﹙P＜0.05﹚，結(jié)果與Seong等不一致，可能是由于其對鼻黏膜刺激物為炎癥介質(zhì)混合物，而本研究為單純的IL-1β。

本研究結(jié)果表明IL-1β能上調(diào)鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5ACmRNA的表達(dá)，然而，IL-1β通過何種途徑調(diào)節(jié)粘蛋白MUC5AC基因的表達(dá)和蛋白的分泌仍有待進(jìn)一步研究。

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Effects of MUC5AC gene expression in human nasal epithelial cells lnduced by lnterleukin-1beta

HUANG Xue-kun，LI Yuan，LIU Hong，et al．Department of Otorhinolaryngology，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sun University，Guangzhou，510630，China

ObjectiveTo demonstrate the effects of IL-1β on MUC5AC gene expression in cultured human nasal epithelial cells.MethodsIn passage-2 cultured human nasal epithelial cells，the mRNA levels of MUC5AC gene expression induced by IL-1β were determined by Fluorescent quantitative nested RT-PCR.Results

MUC5AC mRNAs were detected after 24 h of exposure to IL-1β.MUC5AC mRNA levels in IL-1β treatment［(4.60±1.89)108copy/μg］?were significantly higher than control［(2.50±1.40)107copy/μg］(P＜0.05) .ConclusionIL-1β increased MUC5AC mRNA levels in human nasal epithelial cells.These results suggest that IL-1β may enhance mucin gene expression in cultured human nasal epithelial cells．

Interleukin-1β;Mucin;RT-PCR

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(黃雪琨李源劉紅張革化);中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司(徐偉杰)