劉學偉，劉天宇，劉樹民，湯 青

（黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，哈爾濱市 150040）

龍膽堿在大鼠體內的藥動學特征及透過血腦屏障的研究Δ

劉學偉＊，劉天宇，劉樹民#，湯 青

（黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，哈爾濱市 150040）

目的：利用高效液相色譜（HPLC）法研究龍膽堿的藥動學特征及判斷其是否透過血腦屏障。方法：大鼠經(jīng)尾靜脈注射龍膽堿后，斷尾取血，離心后分離血清，經(jīng)固相萃取柱（SPE）沉淀蛋白。色譜柱為Diamonsil-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-水（梯度洗脫），全波長掃描，流速為1.0mL·min-1。在此基礎上，采用腹腔注射龍膽堿后斷頭取腦，用HPLC法測定腦中龍膽堿含量，依據(jù)龍膽堿給藥劑量與腦內含量的值推算龍膽堿是否透過血腦屏障。結果：龍膽堿線性回歸方程為A＝2.445×107c－44388.6（r＝0.9997，n＝6），表明龍膽堿血清濃度在3.125×10-4～0.1mg·mL-1范圍內與峰面積積分值線性關系良好；最低檢出濃度為0.02μg·mL-1；主要藥動學參數(shù)t1/2a＝8.62min，t1/2β＝116.64min，AUC＝3.57mg·min·mL-1，CL（s）＝28.05mg2·kg-1·mL-1·min-1。在大鼠腦內能檢測到龍膽堿，且其含量隨給藥劑量增加而增加。結論：靜脈注射龍膽堿的大鼠其體內藥動學呈開放二室模型；龍膽堿能透過血腦屏障。

龍膽堿；藥動學；高效液相色譜法；血腦屏障

龍膽是龍膽科植物龍膽、三花龍膽、條葉龍膽或堅龍膽的干燥根及根莖，具有清熱燥濕、瀉肝定驚的功效。一直以來，龍膽中主要成分龍膽苦苷被認為是龍膽的主要活性成分，具有多方面的藥理作用[1]。近年來研究表明，龍膽苦苷在體內經(jīng)腸道菌群作用后會部分生成龍膽堿等代謝產(chǎn)物[2]，因此有人推測，龍膽的藥理作用可能是龍膽苦苷與龍膽堿的協(xié)同作用。國內一些研究也證實龍膽堿具有抗炎[3，4]、降血壓[5]及升血糖等作用[6]。本課題組也證實龍膽堿具有明顯的抗驚厥及腦損傷保護作用，能延長驚厥潛伏期，縮短驚厥持續(xù)時間，并緩解驚厥所致的神經(jīng)元損傷[7，8]。因此，明確龍膽堿能否透過血腦屏障是補充其抗驚厥作用的重要依據(jù)。此外，有關龍膽堿的藥動學研究尚未見報道，闡明龍膽堿藥動學特征，對進一步研究龍膽堿也具有積極的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

2695 型高效液相色譜（HPLC）儀、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；Milli-Q型去離子水機（法國Millipore公司）；KDC-160HR型高速冷凍離心機（安徽科大創(chuàng)新股份有限公司）；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機、AGBS124S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

龍膽堿標準品（筆者自制[9]，經(jīng) UV、IR、1H-NMR、13CNMR、MS鑒定；經(jīng)HPLC檢測含量＞98.4%）；甲醇為色譜純，水為實驗室自制超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級SD大鼠43只，♂，體重（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全評價中心提供（動物質量合格證號：01-10-2號）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（在20min內從40∶60到60∶40，梯度洗脫），全波長掃描；流速：1.0mL·min-1。

2.2 標準溶液的制備

精密稱取龍膽堿標準品1.0mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定量至刻度，配制質量濃度為0.2mg·mL-1的溶液，依次用甲醇倍比稀釋成系列濃度，4℃貯藏，備用。

2.3 血清樣品的處理

大鼠經(jīng)剪尾取血0.5mL，置于1mL離心管中，8000r·min-1離心15min，離心2次，分離血清，－20℃貯藏，備用。取上述血清0.1mL，加入4%H3PO4溶液0.1mL，渦旋60s混勻，用微量移液器分多次壓入SPE柱（避免帶入氣泡），依次用1mL水、1mL 5%甲醇沖去雜質，100%甲醇洗脫，定容至1mL，揮干，并用0.2mL甲醇溶解，經(jīng)0.45μm有機相微孔濾膜濾過，取濾液10μL進HPLC測定含量。SPE柱的活化方法為：依次用1mL甲醇、1mL蒸餾水沖洗2次，最后壓出全部液體。

2.4 藥動學研究

取SD♂健康大鼠15只，隨機均分為3組。給藥前24h禁食不禁水，經(jīng)尾iv龍膽堿，劑量分別為10、50、100mg·kg-1，并于給藥后 5、15、30、60、120、240、360、480min剪尾取血 0.5mL，置于1mL離心管中，按“2.3”項下方法操作，由標準曲線方程計算龍膽堿的血藥濃度。

2.5 龍膽堿透過血腦屏障研究

2.5.1 腦內龍膽堿最大檢測濃度出現(xiàn)時間的確定 取SD♂健康大鼠18只，隨機均分為9組。給藥前24h禁食不禁水，ip龍膽堿（100mg·kg-1）。分別于給藥前與給藥后5、15、30、60、120、240、360、480min先尾靜脈取血，處理同“2.3”項下方法；再用20%烏拉坦麻醉，開胸腔后心臟灌流150mL生理鹽水以沖去腦中血液，斷頭，于冰浴上取腦，腦勻漿后取上清液按“2.3”項下SPE小柱處理樣品法操作。由標準曲線方程計算龍膽堿的血藥濃度及腦中含量。2.5.2龍膽堿是否透過血腦屏障的研究 取SD♂健康大鼠10只，隨機均分為5組。給藥前24h禁食不禁水，ip龍膽堿，劑量分別為10、25、50、75、100mg·kg-1。按“2.5.1”項下得出的最佳時間于給藥后用20%烏拉坦麻醉，開胸腔，心臟灌流150mL生理鹽水以沖去腦中殘留血液，斷頭，于冰浴上取腦，腦勻漿后取上清液按“2.3”項下SPE柱處理樣品法操作。由標準曲線方程計算龍膽堿在腦中的含量。

2.6 標準曲線的制備

精密移取100μL空白血清，置于1mL離心管中，分別精密加入“2.2”項下龍膽堿系列標準溶液100μL，使龍膽堿濃度分別為0.1、0.05、0.025、0.0125、6.25×10-3、3.125×10-3、3.125×10-4mg·mL-1，按“2.3”項下方法操作，進樣分析。以血漿中龍膽堿的濃度（c）為橫坐標，峰面積積分值（A）為縱坐標，進行線性回歸。

3 結果

3.1 色譜行為

龍膽堿與其他干擾組分分離效果良好，無雜質峰干擾，在此色譜條件下，tR為8.1min左右，與相鄰色譜峰分離度均＞1.5。色譜見圖1。

3.2 線性范圍

線性回歸方程為A＝2.445×107c－44388.6（r＝0.9979，n＝6）。表明龍膽堿檢測濃度在3.125×10-4～0.1mg·mL-1范圍內與其峰面積積分值呈良好線性關系。最低定量濃度為0.3125μg·mL-1，最低檢出濃度為0.02μg·mL-1（S/N＝3）。

3.3 回收率與精密度試驗

精密移取100μL空白血清，置于1mL離心管中，共15份，分為3組，各組分別加龍膽堿標準溶液配制成0.005、0.025、0.05mg·mL-1的3種已知濃度的血清樣品，同“2.3”項下方法操作，進行方法的相對回收率和精密度試驗。回收率與精密度試驗結果見表1。

表1 回收率與精密度試驗結果Tab1 Results of sample recovery and precision tests

3.4 穩(wěn)定性試驗

考察樣品凍融3周期及經(jīng)處理后的血漿樣品在室溫避光放置24h的穩(wěn)定性。按“2.6”項下方法分別配制龍膽堿濃度為0.1、0.05、0.025、0.0125、6.25×10-3、3.125×10-3、3.125×10-4mg·mL-1的血清質量控制樣品（n＝3），分別在不同條件下貯藏，測得凍融1周期血漿濃度的相對偏差RE[RE＝（實測值－理論值）/理論值]在±5.18%范圍內；凍融3周期血漿濃度的RE在±6.05%范圍內；經(jīng)處理后的血漿樣品在室溫避光放置24h后的血漿濃度的RE在±4.25%范圍內。結果表明，血清樣品的分析方法符合有關規(guī)范要求。

3.5 藥動學參數(shù)計算及結果

將測得的血藥濃度數(shù)據(jù)用3p97藥動學程序擬合計算，結果表明，龍膽堿在大鼠體內的藥動過程符合二室模型。龍膽堿在大鼠體內的主要藥動學參數(shù)見表2；大鼠給藥后龍膽堿平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

表2 龍膽堿在大鼠體內的主要藥動學參數(shù)Tab2 Main pharmacokinetic parameters of gentianine in rats

圖2 大鼠給藥后龍膽堿平均血藥濃度-時間曲線（n＝3）Fig2 Mean plasma concentration-time curves of gentianine in rats with intravenous administration（n＝3）

3.6 龍膽堿在腦內最大檢測含量出現(xiàn)時間的確定

由血藥濃度-時間曲線及腦內濃度-時間曲線（圖3）可以看出，ip龍膽堿后最大血藥濃度出現(xiàn)時間為給藥后15min，而腦中最大含量出現(xiàn)時間為給藥后30min。龍膽堿濃度隨時間變化見圖4。

圖3 不同劑量龍膽堿在腦內濃度變化Fig3 The content of gentianine in cerebral tissue with different dose administration of it

3.7 龍膽堿透過血腦屏障的確定

圖4 龍膽堿濃度隨時間變化圖A.血藥濃度隨時間變化；B.腦內濃度隨時間變化Fig4 Changes of gentianine concentration with timeA.plasma concentration of gentianine changes with time；B.the content of gentianine in cerebral tissue changes with time

ip不同劑量龍膽堿30min后，各組大鼠腦中龍膽堿濃度隨劑量增加而增加，因此可以排除腦中殘留血液的影響，表明龍膽堿能夠透過血腦屏障。不同劑量龍膽堿在腦內濃度變化見圖3。

4 討論

藥動學的首選動物應與藥效學或毒理學研究一致。依據(jù)前期實驗，本研究選擇的動物是大鼠。筆者設計了3個劑量組，以了解龍膽堿在體內的動力學過程是線性動力學還是非線性動力學，因為不同的動力學模型處理方法不同。為了減少不同動物之間的差異，取血應從同一只動物連續(xù)取血，為保證多次取血并使動物能夠清醒和存活，故確定尾靜脈取血。

本研究進行了血清處理方法的考察。在空白血清中加入已知含量的龍膽堿，分別采用甲醇、乙腈、高氯酸處理血清、沉淀蛋白、離心后取上清液進HPLC測定含量，以回收率為指標，結果都不理想。后來采用固相萃取柱處理血清，并分別考察了不同類型SPE柱和不同的洗脫條件，最終確定了文中血清處理方法，回收率在90%以上。

物質透過血腦屏障主要有4條途徑：水溶性小分子直接經(jīng)細胞間隙擴散；脂溶性分子的跨膜擴散；特異受體介導的胞飲作用；特異載體通道和酶系統(tǒng)的激活[10]。藥物透過血腦屏障的能力通常與藥物本身的相對分子質量、脂溶性、荷電性、同血漿蛋白的結合能力以及特定的載體或受體轉運系統(tǒng)有關。一般來講，分子量越小，脂溶性越強，其透過血腦屏障的能力越強。龍膽堿是脂溶性小分子物質，前期研究表明龍膽堿有抗驚厥及腦保護作用，提示龍膽堿透過血腦屏障可能是其發(fā)揮藥理作用的基礎。

目前檢測藥物通過血腦屏障的方法按實驗對象主要分為四大類：動物活體、離體腦組織、體外血腦屏障模型、數(shù)學模型。通過綜合比較各種方法的優(yōu)劣與具體實驗時的客觀條件，筆者考慮采用活體動物為實驗模型，分離腦組織后檢測腦內龍膽堿含量。首先通過設計的時間點分別取血和腦組織，通過HPLC法確定最佳的采血與取腦時間點，同時取血和腦組織能保證檢測的準確性。隨后，為消除腦內血管殘留的血液中龍膽堿對檢測結果的影響，筆者采用同樣體積的生理鹽水進行心臟灌流，盡可能地沖出腦內的殘余血液；為進一步消除沖洗后殘留的血液，筆者又通過設定不同的給藥劑量，分別在最佳取腦時間點取腦，因腦內殘留的血液中龍膽堿含量基本相同。若藥物能夠通過血腦屏障，隨著給藥劑量增加，透過血腦屏障的量也會增加，則腦內檢測到的含量也會相應的增加，表現(xiàn)為正向曲線；若不能透過血腦屏障，則應為一條直線或近似直線。研究結果表明，龍膽堿能夠透過血腦屏障。

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Pharmacokinetic Characteristics and Blood-brain Barrier Transport of Gentianine in Rats

LIU Xue-wei，LIU Tian-yu，LIU Shu-min，TANG Qing
（Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetic characteristics and blood-brain barrier transport of gentianine in rats by HPLC.METHODS：Rats were treated by caudal vein injection of gentianine，then cut the tails，the blood was collected into centrifuge tube.Serum was separated by centrifugation and SPE method was used to deposit proteins.The separation was performed on Diamonsil-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-water（gradient elution）.We performed a whole wavelength scanning at flow rate of 1.0mL·min-1.Then those rats were treated with gentianine intraperitoneally and decapitated.The concentration of gentianine was determined by HPLC.Whether gentianine delivered through blood-brain barrier was evaluated according to the dose of gentianine and the content of it in cerebral tissue.RESULTS:The linear regression equation of gentianine wasA＝2.445×10-7c－44388.6（r＝0.9997，n＝6）.The linear range of gentianine was 3.125×10-4～0.1mg·mL-1，and the lowest detection limit of gentianine was 0.02μg·mL-1.Main pharmacokinetics parameters of gentianine weret1/2α＝8.62min，t1/2β＝116.64min，AUC＝3.57mg·min·mL-1，CL（s）＝28.05mg2·kg-1·mL-1·min-1；Gentianine could be determined in cerebral tissue of rats，and the content of it in cerebral tissue increased as long as the dose of gentianine increased.CONCLUSION:The pharmacokinetic procedure of gentianine with intravenous administration could be described as open two-compartment model;gentianine can deliver across the blood-brain barrier.

Gentianine；Pharmacokinetics；HPLC；BBB

R285；R97

A

1001-0408（2011）19-1734-04

Δ國家教育部科技重點項目（207029）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥藥理學與神經(jīng)科學。電話：0451-82196274。E-mail：liuxuewei2001@163.com

#通訊作者：教授，博士研究生導師。研究方向：中藥藥效物質基礎。電話：0451-82196163。E-mail：lsm@hljucm.net

book=1737,ebook=361

2010-09-12

2010-12-19）