幸海燕，夏培元，戴 青，陳劍鴻，孫鳳軍

（第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家藥品研究臨床藥理基地，重慶市 400038）

HPLC法測定人肝細胞L02內(nèi)外液中金絲桃苷的含量Δ

幸海燕＊，夏培元#，戴 青，陳劍鴻，孫鳳軍

（第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家藥品研究臨床藥理基地，重慶市 400038）

目的：建立測定人肝細胞L02內(nèi)、外液中金絲桃苷（Hyp）含量的方法。方法：以80μg·mL-1的Hyp與L02共孵育0、3、6、12、24h后，采用高效液相色譜（HPLC）法測定細胞內(nèi)、外液中金絲桃苷的含量。色譜柱為KROMASIL C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.4%磷酸（45∶55），柱溫為30℃，流速為1.0mL·min-1，紫外檢測波長為360nm。結(jié)果：細胞外液中Hyp的標準曲線為Y＝35.412X－8.586（r＝0.9999），表明Hyp檢測濃度在2～200μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系；細胞內(nèi)液中Hyp的標準曲線為Y＝35.759X－7.422（r＝0.9999），表明Hyp檢測濃度在0.1～10μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。細胞外、內(nèi)液中Hyp的平均回收率分別為（96.00±2.43）%、（97.18±4.62）%，平均日內(nèi)RSD分別為1.98%、4.36%，平均日間RSD分別為1.75%、2.86%。樣品溶液處理后室溫放置22h，未處理樣品溶液于－20℃放置6d，平均RSD均＜5%。結(jié)論：本方法簡單、準確、線性范圍寬、靈敏度高、精密度和回收率良好，可為進一步研究Hyp的抗氧化作用與機制奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

高效液相色譜法；人肝細胞L02；金絲桃苷

金絲桃苷（Hyperoside，Hyp）屬黃酮醇苷化合物，結(jié)構(gòu)為槲皮素-3-半乳糖苷，是臨床上疏肝解郁、清熱解毒藥方中金銀花、菟絲子、貫葉連翹、山楂等的主要黃酮類活性成分?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，Hyp對缺血性腦損傷、心肌損傷、肝損傷與腎損傷均有顯著保護效應(yīng)，其作用機制主要為抗氧化[1，2]。Hyp進入細胞并維持一定的濃度，是其發(fā)揮抗氧化作用的首要前提。因此，測定細胞內(nèi)、外液中Hyp的含量有助于了解其在細胞內(nèi)的潴留情況，以便為Hyp的抗氧化作用與機制研究提供充分的證據(jù)。本文以人肝細胞L02為研究模型，建立以高效液相色譜（HPLC）法測定L02細胞內(nèi)、外液中Hyp含量的方法，為Hyp的抗氧化研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1100 HPLC系統(tǒng)（美國Agilent公司）；CL31R型離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Q型超純水器（美國Milli-Qplus公司）；MODEL3111型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司）；Hyp原料藥（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號：ZL0910010A，純度：98%）；Hyp對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：1521-200202）；去離子水（筆者自制）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 細胞

人肝細胞L02購自中國科學(xué)院上海細胞生物所細胞中心。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與處理

L02與以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整密度至2.25×105·mL-1，接種于75cm2細胞培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h。加藥處理時，細胞用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)。

待細胞處理結(jié)束后收集培養(yǎng)液，于4℃、12000r·min-1離心10min，小心吸取2mL上清置EP管中，即為細胞外樣品溶液。以5mL冷的PBS洗滌細胞2次后，加入5mL新的含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于－70℃與37℃反復(fù)凍融3次，收集細胞裂解物于4℃、16000r·min-1離心10min，吸取2mL上清置EP管中，即為細胞內(nèi)樣品溶液。

2.2 標準溶液的制備

準確稱取Hyp對照品適量，以甲醇溶解制成濃度為1mg·mL-1的標準貯備液，4℃貯藏，備用。

用空白細胞外樣品溶液稀釋Hyp標準貯備液，配制成濃度分別為2、5、10、20、50、100、200μg·mL-1的細胞外標準溶液。用空白細胞內(nèi)樣品溶液稀釋Hyp標準貯備液，配制成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg·mL-1的細胞內(nèi)標準溶液，4℃貯藏，備用

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件[3]色譜柱：KROMASIL C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸（45∶55）；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min-1；紫外檢測波長：360nm；進樣體積：30μL。

2.3.2 標準曲線的制備 以“2.2”項下方法制得的標準溶液按1∶1比例加入甲醇，充分混勻后于13000r·min-1離心5min，小心吸取上清，自動進樣30μL，以Hyp峰面積積分值（Y）為縱坐標，Hyp濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸。

2.3.3 回收率、精密度和穩(wěn)定性試驗 用空白細胞外樣品溶液稀釋Hyp標準貯備液，配制成質(zhì)量濃度分別為5、20、100μg·mL-1的細胞外樣品溶液；用空白細胞內(nèi)樣品溶液，精密加入Hyp標準貯備液，配制成濃度分別為0.2、1、5μg·mL-1的細胞內(nèi)樣品溶液，自動進樣30μL（每個濃度進樣5針），記錄色譜峰峰面積，按回歸方程計算回收率。同法制備上述溶液，于日內(nèi)與日間（5d）進樣，考察方法精密度。處理后的樣品溶液室溫下避光放置10、22h，未處理的樣品溶液于－20℃放置3、6d后分別測定Hyp含量，考察樣品穩(wěn)定性。

2.4 細胞內(nèi)、外液中Hyp的含量測定

按不同時間段將L02分為5組，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整密度至2.25×105·mL-1，接種于75cm2細胞培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h后，加入Hyp濃度為80μg·mL-1的含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。分別于加藥后0、3、6、12、24h按“2.1”項下方法收集得細胞內(nèi)、外樣品溶液。樣品溶液按1∶1的比例加入甲醇，充分混勻后于13000r·min-1離心5min，小心吸取上清，取30μL 進樣，進行HPLC分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

試驗數(shù)據(jù)以±s表示，由SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性

分別取空白細胞樣品溶液、標準溶液、樣品溶液進樣測定。結(jié)果表明，在本色譜條件下，細胞內(nèi)、外液中內(nèi)源性物質(zhì)對Hyp的測定無干擾，Hyp的保留時間分別約為8.11、8.08min。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白細胞外樣品溶液；B.細胞外標準溶液；C.細胞外樣品溶液；D.空白細胞內(nèi)樣品溶液；E.細胞內(nèi)標準溶液；F.細胞內(nèi)樣品溶液Fig1 Chromatogram of Hyp in L02cellsA.blank extracellular solution；B.extracellular standard solution；C.extracellular sample；D.blank intracellular solution；E.intracellular standard solution；F.intracellular sample

3.2 線性關(guān)系

得細胞外樣品回歸方程為Y＝35.412X－8.586（r＝0.9999）；細胞內(nèi)樣品回歸方程為Y＝35.759X－7.422（r＝0.9999）。結(jié)果表明，細胞外樣品中Hyp檢測濃度在2～200μg·mL-1范圍內(nèi)、細胞內(nèi)樣品中Hyp檢測濃度在0.1～10μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。細胞內(nèi)、外液的定量限分別為0.1、2μg·mL-1。

3.3 回收率與精密度試驗

按照“2.3.3”項下方法測定高、中、低濃度回收率，結(jié)果細胞外液分別為（98.60± 1.52）%、（94.91±1.63）%、（94.50±4.14）%，細胞內(nèi)液分別為（98.09±2.07）%、（95.52±3.60）%、（97.91±8.20）%。細胞外、內(nèi)液的日內(nèi)平均RSD分別為1.98%、4.36%，日間平均RSD分別為1.75%、2.86%，表明本分析方法準確度高、穩(wěn)定性好?；厥章逝c精密度試驗結(jié)果見表1。

表1 回收率與精密度試驗結(jié)果（±s）Tab1 Results of recovery and precision test（s±s）

表1 回收率與精密度試驗結(jié)果（±s）Tab1 Results of recovery and precision test（s±s）

樣品類型細胞外液細胞內(nèi)液c/μg·mL-1 5201000.215相對回收率/%94.50±4.1494.91±1.6398.60±1.5297.91±8.2095.52±3.6098.09±2.07日內(nèi)RSD/%2.981.491.468.672.292.13日間RSD/%1.042.381.824.513.110.96

3.4 穩(wěn)定性試驗

按照“2.3.3”項下方法處理后的樣品，避光貯藏的穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，細胞外樣品溶液處理后室溫避光放置10、22h，未處理溶液于－20℃放置3、6d的平均RSD分別為0.9%、4.5%、0.5%、0.5%；細胞內(nèi)樣品溶液分別為0.4%、1.1%、1.0%、1.0%。Hyp在細胞內(nèi)、外液中的放置穩(wěn)定性見表2。

表2 Hyp在細胞內(nèi)、外液中的放置穩(wěn)定性（n＝5）Tab2 Stability of Hyp in L02cells（n＝5）

3.5 樣品含量測定

按照“2.4”項下方法檢測各時間點細胞內(nèi)、外液中Hyp含量。結(jié)果表明，隨著孵育時間的增加，進入細胞內(nèi)的Hyp量也逐漸增加。細胞培養(yǎng)12h，進入細胞內(nèi)的Hyp達峰值11.88%，隨后細胞內(nèi)的Hyp含量又緩慢下降。不同時間點細胞內(nèi)、外液中Hyp的含量見表3。

表3 不同時間點細胞內(nèi)、外液中Hyp的含量（n＝3）Tab3 Concentration of Hyp in L02cells after exposure to Hyp solution for various time（n＝3）

4 討論

目前，L02被廣泛用作藥物肝保護效應(yīng)研究的模型[4，5]，但有關(guān)HPLC法測定L02細胞內(nèi)、外液中肝保護藥物的含量卻尚未見報道。本研究以了解Hyp在L02內(nèi)的潴留過程為目的，建立了細胞內(nèi)、外液中Hyp含量測定的HPLC法，為抗氧化研究中Hyp的給藥濃度與時間的選擇提供了充分的證據(jù)。

本研究在參考文獻[6]的基礎(chǔ)上，采用反復(fù)凍融的方法制備細胞內(nèi)樣品溶液。3次凍融結(jié)束后，在顯微鏡下未見形態(tài)完整的細胞，說明細胞破碎成功。該方法既避免了使用化學(xué)試劑破碎細胞帶來的試驗干擾，也能夠保持檢測藥物的完整性，且本方法簡便易行、重復(fù)性好，符合HPLC檢測要求。

此外，本研究僅采用甲醇沉淀蛋白進行樣品前處理，整個操作過程較為簡單。因此，在確保準確進樣、平行操作的前提下，選用簡便易行的外標法進行Hyp的定量測定[7，8]。樣品檢測結(jié)果顯示，終濃度為80μg·mL-1的Hyp與L02共孵育12h后，進入細胞內(nèi)的Hyp達到峰值（11.88%），24h后又逐漸降低，這提示在后續(xù)的抗氧化研究中Hyp預(yù)保護L02的時間最好設(shè)在12～24h范圍內(nèi)。雖然Hyp的結(jié)構(gòu)中含有糖基，進入細胞的能力較其他脂溶性藥物低，但水溶性的增加也可以減少溶液配制時DMSO等助溶劑的使用，從而減少對細胞的毒性。孵育24h后，細胞內(nèi)Hyp濃度逐漸降低，提示可能與其轉(zhuǎn)變成其他代謝產(chǎn)物有關(guān)[9，10]。據(jù)報道，Hyp進入細胞后可以原型或代謝產(chǎn)物形式，通過螯合金屬離子、直接清除自由基、調(diào)節(jié)細胞凋亡蛋白表達等機制發(fā)揮對各種細胞的保護效應(yīng)[11，12]。

綜上所述，本文建立的HPLC方法專屬性好，回收率、精密度高，且方法簡便、準確，可快捷地分析Hyp在細胞內(nèi)、外動態(tài)變化的規(guī)律，可為進一步探討Hyp的抗氧化效應(yīng)和機制奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

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Content Determination of Hyperoside in L02Cells by HPLC

XING Hai-yan，XIA Pei-yuan，DAI Qing，CHEN Jian-hong，SUN Feng-jun
（State Base of Drug Research and Clinical Pharmacology，The First Affiliated Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC method for the content determination of hyperoside（Hyp）in L02cells.METHODS：HPLC was used to determine the concentrations of Hyp in L02cells，after co-cultured with Hyp at the concentration of 80μg·mL-1for 0，3，6，12，24h.HPLC analysis was performed on a KROMASIL C18（250mm×4.6mm，5μm）column at flow rate of 1.0mL·min-1using methanol-0.4%phosphoric acid（45∶55）as mobile phase with UV detection at 360nm.The column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range of extracellular Hyp was 2～200μg·mL-1and that of intracellular Hyp was 0.1～10μg·mL-1（r＝0.9999）.The standard curves of extracellular Hyp wasY＝35.759X－7.422and that of intracellular Hyp wasY＝35.412X－8.586.Average recovery rates of extracellular and intracellular Hyp were（96.00%±2.43%）and（97.18%±4.62%）.The RSD of intra-day and inter-day were 1.75%and 2.86%，respectively.The treated samples were kept at room temperature for 22hours and untreated samples were kept at－20℃ for 6days.The average RSD was below 5%.CONCLUSION：The results show that established HPLC method is simple，accurate and sensitive for the content determination of Hyp in L02cells.The wide liner range，satisfied precision and good mean recovery guarantee it can be used for further study of antioxidative effect of Hyp.

HPLC；L02cells；Hyperoside

R285；R969

A

1001-0408（2011）19-1731-04

Δ國家自然科學(xué)基金資助項目（30572366）

＊博士研究生。研究方向：天然植物藥的藥理學(xué)。電話：023-68765991。E-mail：haiyanxing@yahoo.com.cn

#通訊作者：教授，博士研究生導(dǎo)師，博士。研究方向：新藥藥理研究及評價。電話：023-68754438。E-mail：py_xia@yahoo.com.cn

2010-09-10

2010-10-26）