張小華

（重慶市腫瘤研究所，重慶市 400030）

白藜蘆醇對(duì)慢性肝損傷模型小鼠的肝保護(hù)作用研究

張小華＊

（重慶市腫瘤研究所，重慶市 400030）

目的：研究白藜蘆醇對(duì)慢性肝損傷模型小鼠的肝保護(hù)作用及內(nèi)毒素（Lps）刺激引起肝臟枯否細(xì)胞（KCs）分泌細(xì)胞因子的變化。方法：取小鼠36只隨機(jī)均分為正常對(duì)照組（正常飲食）、模型組（高脂飲食）、藥物組（高脂飲食，0.5%白藜蘆醇10mL·kg－1）、陽(yáng)性對(duì)照組（高脂飲食，聯(lián)苯雙酯150mg·kg－1），每隔1日灌胃給藥1次，10周后每組抽取7只小鼠，腹主動(dòng)脈采血測(cè)定血漿中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平；分離培養(yǎng)肝臟KCs，檢測(cè)在Lps刺激下KCs上清液中IL-6、IL-10、TNF-α的水平。結(jié)果：與模型組比較，藥物組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血漿中ALT、IL-6水平明顯降低（P＜0.05），IL-10、TNF-α無(wú)明顯變化；小鼠肝臟KCs上清液中IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：白藜蘆醇可能通過(guò)降低KCs對(duì)促炎因子（IL-6、TNF-α）的表達(dá)，提高KCs對(duì)抑炎因子（IL-10）的表達(dá)，來(lái)實(shí)現(xiàn)其肝臟保護(hù)作用。

白藜蘆醇；慢性肝損傷；小鼠；枯否細(xì)胞；保護(hù)作用

白藜蘆醇能夠阻止低密度脂蛋白的氧化，具有潛在的防治心血管疾病、防癌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用，其作用主要表現(xiàn)為抗氧化特性[1]。有研究[2]表明，白藜蘆醇對(duì)高脂飲食引起的慢性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，但機(jī)制尚未闡明。為此，筆者通過(guò)建立小鼠慢性肝損傷模型，考察白藜蘆醇對(duì)其的肝保護(hù)作用及內(nèi)毒素（Lps）刺激引起肝臟枯否細(xì)胞（KCs）分泌細(xì)胞因子的變化。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Cobas 6000全自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司）；Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 試藥

白藜蘆醇（湖北金龍福藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20080718，純度：99.9%）；聯(lián)苯雙酯（湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20060123，純度：99%）；Ⅳ型膠原酶、胎牛血清培養(yǎng)液（DMEM）、細(xì)胞分離液（Percoll液）、Lps（美國(guó)Sigma公司）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、膽固醇（北京化學(xué)試劑公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司，批號(hào)：200810096）。

1.3 動(dòng)物

BaB/C小鼠，SPF級(jí)，♀，4周齡，體重20～30g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（渝）2007-0001。

2 方法

2.1 分組與給藥

取小鼠36只，正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、藥物組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組9只。正常對(duì)照組正常飲食飼養(yǎng)；模型組高脂飲食（普通飼料+5%的膽固醇+15%的玉米油）飼養(yǎng)；藥物組高脂飲食飼養(yǎng)，同時(shí)每隔1日灌胃給予0.5%白藜蘆醇10mL·kg－1[3]1次；陽(yáng)性對(duì)照組高脂飲食飼養(yǎng)，同時(shí)每隔1日灌胃給予聯(lián)苯雙酯150mg·kg－1[4]1次。

2.2 血漿指標(biāo)的檢測(cè)

10周后，每組隨機(jī)抽取7只小鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后腹主動(dòng)脈采血，經(jīng)肝素抗凝后，3000r·min－1離心10min，分離血漿，用于ALT、IL-6、IL-10、TNF-α水平的檢測(cè)。

2.3 病理學(xué)檢查與肝臟KCs分離

小鼠采血后處死，取肝左葉置于10%中性福爾馬林中固定，切片，觀察肝臟病理學(xué)變化；另采用改進(jìn)Seglen膠原酶2步灌流和Percoll液密度梯度離心法分離得到各組小鼠肝臟KCs，經(jīng)5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育4h，洗去未貼壁細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)非特導(dǎo)性酯酶染色，活性和純度分別達(dá)到95%時(shí)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為每1mL 5×106個(gè)，接種于48孔培養(yǎng)板中，每組8孔。

2.4 細(xì)胞因子的檢測(cè)

于培養(yǎng)液中加入100mg·mL－1Lps 2滴，4h后收集培養(yǎng)上清液，用于促炎因子（IL-6、TNF-α）和抑炎因子（IL-10）的測(cè)定。

2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（SNK法）。

3 結(jié)果

3.1 肝組織病理學(xué)變化

與正常對(duì)照組比較，模型組與藥物組小鼠的肝組織均出現(xiàn)不同程度的彌散性改變，肝內(nèi)可見(jiàn)大量的脂肪空泡（肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)＞1/3）及肝細(xì)胞氣球樣變，小葉內(nèi)和匯管區(qū)有大量的以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見(jiàn)明顯肝纖維化。與模型組比較，藥物組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。

3.2 血漿中ALT水平的變化

結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠血漿中ALT活性為（61.5±12.6）u·L－1，而模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物組小鼠血漿中ALT活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05），分別為（210.3±105.4）、（184.1±52.1）、（144.1±72.9）u·L－1。與模型組比較，藥物組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血漿中ALT水平顯著降低（P＜0.05）。

3.3 血漿中IL-6、IL-10、TNF-α的變化

與正常對(duì)照組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物組小鼠血漿中IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平則明顯減低。與模型組比較，藥物組小鼠血漿中IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，其中IL-6具有顯著性差異（P＜0.05）。各組小鼠血漿中IL-6、TNF-α、IL-10水平比較詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血漿中IL-6、TNF-α、IL-10水平比較（±s，n＝7）Tab1 Comparison of the levels of IL-6，TNF-α and IL-10in mice plasm（a±s，n＝7）

表1 各組小鼠血漿中IL-6、TNF-α、IL-10水平比較（±s，n＝7）Tab1 Comparison of the levels of IL-6，TNF-α and IL-10in mice plasm（a±s，n＝7）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05，＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組藥物組陽(yáng)性對(duì)照組IL-10/ng·L－1 37.78±6.0220.71±6.28＊＊28.8±3.79＊29.05±4.35＊IL-6/ng·L－1 153.27±24.92219.56±27.12＊＊186.90±9.51＊#198.34±5.98＊#TNF-α/μg·L－1 2.58±1.615.88±0.64＊＊5.48±0.70＊＊5.44±0.59＊＊

3.4 肝臟KCs的分離結(jié)果

結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠的肝臟KCs體積較小，形態(tài)相對(duì)規(guī)整，胞漿突起纖細(xì)，胞漿內(nèi)僅有少量空泡。而模型組小鼠的肝臟KCs體積明顯增大，核漿比例增大，胞漿突起明顯增多、變粗，胞漿高度空泡化，無(wú)典型的活化狀態(tài)。

3.5 KCs分泌細(xì)胞因子的變化

與正常對(duì)照組比較，模型組與藥物組小鼠肝臟KCs培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，藥物組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝臟KCs培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠肝臟KCs上清液中IL-6、TNF-α、IL-10水平比較詳見(jiàn)表2。

4 討論

近年來(lái)，對(duì)先天肥胖性小鼠研究[5]表明，KCs分泌功能紊亂參與了肝臟疾病的發(fā)生，使其自然發(fā)展成為脂肪肝，特征有胰島素抵抗、肥胖、脂質(zhì)代謝紊亂。對(duì)肥胖、瘦素受體功能紊亂的小鼠，小鼠KCs體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，KCs表型異常，在給予Lps刺激后，促炎因子表達(dá)增強(qiáng)，而抑炎因子表達(dá)減弱[6，7]。盡管肝臟各種細(xì)胞均可產(chǎn)生TNF-α，但普遍認(rèn)為L(zhǎng)ps活化KCs是TNF-α產(chǎn)生的主要來(lái)源[8]。研究表明，TNF-α在脂肪肝炎的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用，其不僅可通過(guò)活化受體，產(chǎn)生各種適應(yīng)性蛋白，促進(jìn)肝細(xì)胞的抗凋亡[9]，也可引發(fā)肝細(xì)胞線粒體釋放出活性氧引起肝細(xì)胞死亡、凋亡和肝臟的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。IL-6是肝臟KCs產(chǎn)生的另一種重要促炎因子，可與TNF-α協(xié)同促進(jìn)肝內(nèi)炎癥的產(chǎn)生。相反IL-10可通過(guò)抑制各種促炎因子的生成，從而減少肝內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。白藜蘆醇是從葡萄籽中提取出的一種有效成分，其作用十分廣泛。為進(jìn)一步證實(shí)白藜蘆醇是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)KCs分泌功能來(lái)改善肝組織慢性損傷，本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食復(fù)制慢性肝損傷模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠發(fā)生脂肪肝炎時(shí)，血漿中IL-6、TNF-α明顯升高而IL-10明顯降低，白藜蘆醇可抑制IL-6水平的升高。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，白藜蘆醇可降低KCs對(duì)IL-6、TNF-α的表達(dá)，在增強(qiáng)IL-10的表達(dá)方面作用十分顯著。說(shuō)明白藜蘆醇可能通過(guò)降低KCs對(duì)促炎因子的表達(dá)、增強(qiáng)KCs對(duì)抑炎因子的表達(dá)，來(lái)實(shí)現(xiàn)其肝臟保護(hù)作用。另外，本文沒(méi)有考察藥物高、中、低劑量的影響，尚有待進(jìn)一步研究。

表2 各組小鼠肝臟KCs上清液中IL-6、TNF-α、IL-10水平比較（±s，n＝7）Tab2 Comparison of the levels of IL-6，TNF-α and IL-10in KCs supernatant（s±s，n＝7）

表2 各組小鼠肝臟KCs上清液中IL-6、TNF-α、IL-10水平比較（±s，n＝7）Tab2 Comparison of the levels of IL-6，TNF-α and IL-10in KCs supernatant（s±s，n＝7）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組藥物組陽(yáng)性對(duì)照組IL-6/ng·L－1 280.08±37.46423.55±23.17＊＊345.88±67.48＊##321.34±51.48＊##TNF-α/μg·L－1 8.25±1.3022.94±8.21＊＊13.47±2.45＊#15.44±1.59＊#IL-10/ng·L－1 38.05±4.4120.71±2.09＊＊24.57±1.61＊#29.05±1.35＊#

[1] 曹 莉，王擁軍.白藜蘆醇對(duì)氧化型低密度脂蛋白所致細(xì)胞損傷的防護(hù)作用[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，39（1）：19.

[2] 陳小夏，何 冰.白藜蘆醇對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床，2008，24（6）：39.

[3] Miatello R，Vázquez M，Renna N，et al.Chronic administration of resveratrol prevents biochemical cardiovascular changes in fructose-fed rats[J].Am J Hypertens，2005，18（6）：864.

[4] 陳紅鴿，年國(guó)俠，楊新波，等.水芹總酚酸對(duì)D-半乳糖胺鹽酸鹽誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（6）：492.

[5] Jens S，Dominik W，Andreas P，et al.Importance of Kupffer cells for T-cell-dependent liver injury in mice[J].Am J Pathol，2000，157（5）：1671.

[6] Biburger M，Tiegs G.Alpha-galactosylceramide-induced liver injury in mice is mediated by TNF-alpha but independent of Kupffer Cells[J].Journal of Immunology，2005，175（3）：1540.

[7] Lefkowitch JH，Haythe JH，Regent N.Kupffer cell aggregation and perivenlar distribution in steatohepatitis[J].Mod Pathol，2002，15（7）：699.

[8] 舒仕瑜，盧仲毅，王興勇.白藜蘆醇苷對(duì)大鼠內(nèi)毒素休克性肺損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥房，2003，14（3）：143.

[9] Roberts RA，Ganey PE，Ju C，et al.Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis[J].Toxicol Sci，2007，96（1）：2.

Protective Effect of Resveratrol on Chronic Liver Injury Mice

ZHANG Xiao-hua
（Chongqing Institute of Tumor Research，Chongqing 400030，China）

OBJECTIVE：To study the protective effect of resveratrol on chronic liver injury mice and the change of cytokines secreted by Kupffer cell（KCs）in response to endotoxin（Lps）stimulation.METHODS：36mice were randomly divided into normal control group（normal diet），model group（high-fat diet），drug group（high-fat diet，0.5%resveratrol 10mL·kg－1），positive control group（high-fat diet，bifendate 150mg·kg－1）.Each group was given medicine every other day.After 10weeks，7mice of each group were sacrificed，blood sample was collected from abdominal artery for testing the levels of ALT，IL-6，IL-10，TNF-α.KCs was isolated and cultured to detect the levels of IL-6，IL-10，TNF-α in KCs supernatants after Lps stimulation.RESULTS：Compared with model group，the levels of ALT and IL-6in drug group and positive group were decreased significantly（P＜0.05）while the levels of IL-10and TNF-α had no significant changes.The levels of IL-6and TNF-α in KCs supernatants decreased significantly while the level of IL-10increased（P＜0.05orP＜0.01）.CONCLUSION：Resveratrol might protect mice liver from chronic injury by decreasing the expression of IL-6and TNF-α and increasing the expression of IL-10.

Resveratrol；Chronic liver injury；Mice；Kupffer cells；Protective effect

R969；R575

A

1001-0408（2011）17-1560-02

＊主管藥師。研究方向：中藥抗腫瘤藥物。電話：023-65301592。E-mail：zxh660114@qq.com

2010-06-18

2010-09-28）