姚建平，金國(guó)琴，戴薇薇，姚齡愛(ài)，康湘萍

本研究通過(guò)觀察自然衰老腎虛大鼠海馬組織五羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)含量與HPA軸活性變化及右歸丸對(duì)其的影響，探索衰老時(shí)海馬組織5-HT、NE含量與HPA軸功能變化的關(guān)系。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級(jí)，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)2003-0002。

1.2 主要試劑與藥品

乙腈(acetonitrile)，HPLC 級(jí)，批號(hào) 020210，上海吳涇化工總廠;氯乙酸(Chloroacetic acid)，分析純，批 號(hào) 017013/1 23903419，F(xiàn)luka公 司;甲 醇(Methanol)，HPLC 級(jí)，批號(hào) 3246A，Sigma-Aldrich Laborchemikallen GmbH;去甲腎上腺素(NE)，優(yōu)級(jí)純，批號(hào)023K0697，Sigma公司;樟腦磺酸(C210–7(1s)-(+)-10camphorsulfonic acid)，分析純，批號(hào)S11/93-024，F(xiàn)luka公司;乙二胺四乙酸，分析純，批號(hào) 015783/120103039，F(xiàn)luka 公 司;5-羥 色 胺 (5-HT)，優(yōu)級(jí)純，批號(hào) 112K7002，Sigma公司;大鼠皮質(zhì)酮放免檢測(cè)試劑盒(Diagnostic Systems Laboratories，Inc)和中藥(飲片)。

1.3 主要儀器

BAS高效液相色譜儀(Bio Analytical Systems，Inc)，BAS LC-4C電化學(xué)探測(cè)器(Bio Analytical Systems，Inc)，VELOSEP RP-18 層析柱(填料直徑為3μm，規(guī)格為3.2×100mm，Perkin Elmer Company)，γ-射線計(jì)數(shù)儀(Beckman Company)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

SD雄性大鼠隨機(jī)分為老年對(duì)照組、右歸丸組，另設(shè)青年對(duì)照組共3組，溫度18℃ ～22℃，光暗周期 12h∶12h，群養(yǎng)，5只/籠，常規(guī)喂養(yǎng)飼料，自由飲水。以自然衰老SD雄性大鼠(24月齡)為模型，老年對(duì)照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)至24月齡。右歸丸組大鼠從20月齡始，按生藥7.5g·kg－1(相當(dāng)成人臨床用量的15倍)自由飲用稀釋藥液，每周停藥2d，連續(xù)4個(gè)月。

2.2 藥材及制劑

右歸丸組方及用量均參照《方劑學(xué)》第1版教材。原方用量:熟地24g，山藥12g，山茱萸9g，枸杞子 9g，菟絲子 12g，鹿角膠 12g，炒杜仲 12g，當(dāng)歸 9g，肉桂6g，炮附子6g。中藥(飲片)一次性購(gòu)于上海華宇藥業(yè)有限公司，按原方用量比例水煎濃縮成膏，－30℃保存。

2.3 取材

大鼠腹腔麻醉(25%烏拉坦，0.75mg/kg)，腹主動(dòng)脈取血 5ml，制備血清(靜置 1h 后，3000r·min－1，離心15min);用消毒手術(shù)器械取大鼠海馬，置于高壓蒸氣滅菌的Eppendorf管中，－70℃保存。

2.4 HPLC-ED檢測(cè)大鼠海馬組織5-HT及NE含量［1、2］

2.4.1 樣品處理 稱取樣品100mg，加入1ml 0.1M HCLO4，冰浴勻漿，組織勻漿液轉(zhuǎn)入 1.5ml Eppendorf離心管中，低溫離心(4℃，14000rpm，15min)后，將上清轉(zhuǎn)入 Eppendorf離心管中，再次低溫離心(4℃，14000rpm，15min)得樣品溶液。

2.4.2 色譜條件 柱溫35℃，電化學(xué)工作電壓 750mV，流速為 0.3ml/min，進(jìn)樣量 5μl/次，流動(dòng)相(0.15mM氯乙酸-氫氧化納，EDTA 0.8mM和 D-樟腦-磺酸9mM，10%甲醇，pH 4.2)。

2.4.3 操作步驟 開(kāi)機(jī)后調(diào)整好各參數(shù)，預(yù)熱1h以200ml 40%乙腈沖洗色譜柱(使用前超聲脫氣)，再以流動(dòng)相平衡色譜系統(tǒng)(使用前超聲脫氣)，進(jìn)混合標(biāo)準(zhǔn)液，繼續(xù)用流動(dòng)相洗脫，待出峰穩(wěn)定后加樣品液，流動(dòng)相洗脫至樣品出峰。樣品間隔用去離子水(18MΩ)沖洗。

2.4.4 定量方法 配制 50 ng/ml、100ng/ml、200ng/ml濃度的去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)標(biāo)準(zhǔn)液以及各標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液。取5μl進(jìn)行色譜分析，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣5次，根據(jù)峰面積平均值作出標(biāo)準(zhǔn)品濃度校正線。樣品峰面積根據(jù)校正線得出濃度值。

2.5 放免法檢測(cè)血中皮質(zhì)酮

按試劑盒說(shuō)明操作，γ-射線計(jì)數(shù)儀檢測(cè) cpm(管/1min)。

2.6 數(shù)據(jù)及結(jié)果分析

所得數(shù)據(jù)均采用珋x±s表示，SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

3 結(jié)果

3.1 右歸丸對(duì)自然衰老大鼠海馬組織5-HT和NE含量的影響

表1顯示，與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組大鼠海馬5-HT含量顯著升高，NE含量顯著降低(P<0.05);與老年對(duì)照組比較，右歸丸組大鼠海馬5-HT含量顯著下降，NE含量顯著升高(P<0.05)。

表1 大鼠海馬5-HT、NE含量(珋x±s，n=8)

3.2 右歸丸對(duì)自然衰老大鼠血清皮質(zhì)酮(CORT)含量的影響

表2顯示，與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組大鼠血清CORT含量顯著增高(P<0.05);與老年對(duì)照組比較，右歸丸組大鼠血清CORT含量顯著下降(P<0.05)。

表2 大鼠血清CORT含量(珋x±s，n=10)

3 討論

5-HT是一種分布廣泛的生物性吲哚胺，由吲哚和乙胺兩部分組成，約1% ～2%存在于CNS中。由于血腦屏障的存在，血液中的5-HT很難進(jìn)入CNS，因此CNS和外周神經(jīng)的5-HT分屬2個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)［3］。NE屬兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，體內(nèi)有三類細(xì)胞能合成NE，即去甲腎上腺素能神經(jīng)元、腎上腺素能神經(jīng)元以及腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞，前兩者作為神經(jīng)遞質(zhì)，而后者則作為激素發(fā)揮作用。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)HPA軸的作用雖然至今仍有爭(zhēng)議，但大量研究表明，NE在調(diào)節(jié) HPA軸中主要起抑制作用［4］，5-HT 可促進(jìn) HPA 軸的活性［5］，并可通過(guò)下丘腦CRH促進(jìn) ACTH的分泌［3］，且5-HT與 NE在促進(jìn)CRH釋放方面呈相互拮抗作用［6］。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，5-HT可以增高培養(yǎng)的下丘腦細(xì)胞CRH的含量及釋放，而 NE可降低 CRH的釋放［7］。5-HT和NE通過(guò)對(duì)CRH釋放的協(xié)調(diào)作用，參與對(duì)HPA軸的調(diào)控。

關(guān)于老年機(jī)體腦內(nèi)5-HT及NE含量變化，研究報(bào)道，衰老過(guò)程中腦內(nèi) NE含量有下降趨勢(shì)［8］，5-HT含量逐漸升高［9］。也有研究提出，衰老過(guò)程中5-HT濃度隨增齡變化不大，而NE濃度下降［10］。但多數(shù)研究結(jié)果表明，衰老時(shí)5-HT/NE比值升高，提示衰老過(guò)程中腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)平衡被打破。聯(lián)系5-HT對(duì)HPA軸的促進(jìn)作用和NE對(duì)HPA軸的抑制作用，推測(cè)這兩類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡對(duì)于維持HPA軸的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)具有重要作用。

腎虛是重要的衰老理論之一，中醫(yī)的“腎”與神經(jīng)內(nèi)分泌尤其與HPA軸之間存在密切聯(lián)系。正常情況下中樞內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)分泌保持在一定水平，以維持HPA軸的穩(wěn)定功能。隨著機(jī)體的老化，神經(jīng)遞質(zhì)分泌與釋放也相應(yīng)發(fā)生增齡性改變，進(jìn)而誘發(fā)HPA軸功能的紊亂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，衰老大鼠海馬組織5-HT含量的升高和NE含量的下降與HPA軸活性增強(qiáng)密切相關(guān)，補(bǔ)腎方藥右歸丸對(duì)海馬組織NE含量的升高和對(duì)5-HT含量的降低作用可能是參與了HPA軸活性的調(diào)節(jié)。

［1］ Feldman S.The excitatory effects of the amygdala on hypothalamus-pituitary-adrenocortical responses are mediated by hypothalamic norepinephrine，serotonin，and CRH-4［J］.Brain Res Bull，1998，45(4):389-395.

［2］ Weidenfeld J，Newman ME，Itzik A，et al.The amygdala regulates the pituitary-adrenocortical response and release of hypothalamic serotonin following electrical stimulation of the dorsal raphe nucleus in the rat［J］.Neuroendocrinology，2002，76(2):63-74.

［3］ Bruley-Resset-M，Vergnon L.Interleukin-1 synthesis and activity in aged mice［J］.Mechanism of Aging and Development，1984，24(3):247-259.

［4］ 李電東.衰老過(guò)程中IL-2和IL-2R表達(dá)的變化［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，1997，11(抗衰老特集):1.

［5］ 宋淑霞，呂占軍，侯潔，等.益氣補(bǔ)腎方藥對(duì)腎虛小鼠細(xì)胞因子IL-l、IL-2及 IL-l2基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2002，10(2):101-104.

［6］ 戴慶堂.白細(xì)胞介素-6與老年病［J］.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，1995，14(5):317-319.

［7］ Riancho JA，Zarrabeitia MT，Amado JA，et al.Age-related differences in cytokine secretion［J］.Gerontol，1994，40(3):8-19.

［8］ John CD， Buckingham JC. Cytokines:regulation of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis［J］. Curr Opin Pharmacol，2003，3(1):78-91.

［9］ Dantzer R，Wollman E.Relationships between the brain and the immune system［J］.Soc Biol，2003，197(2):81-96.

［10］ Ferrari E，F(xiàn)ioravanti M，Magri F，et al.Variability of interactions between neuroendocrine and immunological functions in physiological aging and dementia of the Alzheimer′s type［J］.Ann N Y Acad Sci，2000，917.582-593.