王 敏,姚齊穎,夏滿莉,周新妹,姜春玲

AT1受體在腦膽堿能刺激引起的延髓腹外側(cè)部 TH-IR變化中的作用

王 敏1,姚齊穎2,夏滿莉1,周新妹1,姜春玲2

(1.浙江嘉興學院醫(yī)學院生理學教研室,浙江嘉興 314001;2.大連醫(yī)科大學生理學教研室,遼寧大連 116027)

目的：探討大鼠側(cè)腦室注射膽堿能激動劑氨甲酰膽堿 (carbachol,CBC)后引起的腎排鈉量、腎小球濾過率、腎血漿流量的改變和延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應活性 (thyrosine hydroxylase-immunoreactivity,TH-IR)的變化,以及氯沙坦 (losartan,Los)阻斷腦血管緊張素能 AT1受體后對上述變化的影響。方法：選用 SD雄性大鼠,隨機分成 4組：NS+CBC組、Los+CBC組、Los+NS組、NS+NS組,側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿 (0.5μg)和 /或氯沙坦 (20μg)后,利用整體實驗方法測定腎排鈉量、腎小球濾過率、腎血漿流量;采用免疫組織化學方法觀察大鼠延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應活性的變化。結(jié)果：與 NS+NS組比,大鼠側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿 (0.5μg)后 40 min,腎排鈉量顯著增加,延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,免疫染色強度明顯增加 (P＜0.05);與 NS+CBC組比,氯沙坦預處理后大鼠腎排鈉量顯著下降,延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯下降,免疫染色強度明顯降低 (P＜0.05)。此外,實驗還觀察到,側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿或氯沙坦對腎小球濾過率和腎血漿流量無明顯影響 (P＞0.05)。結(jié)論：大鼠側(cè)腦室給予氨甲酰膽堿后,可顯著引起促鈉排泄反應,對延髓腹外側(cè)部的兒茶酚胺能神經(jīng)元有興奮作用;阻斷腦血管緊張素能 AT1受體可下調(diào)氨甲酰膽堿誘導的上述變化。

卡巴膽堿 /藥理學;受體,血管緊張素,1型 /藥理學;延髓 /藥物作用;氯沙坦 /藥理學

[J Zhejiang Univ(Medical Sci),2011,40(1)：71-77.]

延髓腹外側(cè)部是中樞參與循環(huán)血量調(diào)節(jié)的重要部位。血量擴張可引起清醒家兔延髓腹外側(cè)部 c-fos基因表達增加及促鈉排泄反應[1],但延髓腹外側(cè)部何種神經(jīng)元參與血量擴張引起的促鈉排泄反應尚未見報道。有文獻報道,側(cè)腦室、內(nèi)側(cè)隔區(qū)、藍斑給予膽堿能刺激或腎上腺素能刺激均能引起促鈉排泄反應[2];而α-腎上腺素能受體阻斷劑酚妥拉明可阻斷上述效應[3],提示腦膽堿能系統(tǒng)和腦兒茶酚胺能系統(tǒng)在促鈉排泄反應中有某種聯(lián)系。我們以往的工作證實,下丘腦內(nèi)兒茶酚胺能神經(jīng)元參與腦膽堿能刺激引起的促鈉排泄和利尿反應[4]。神經(jīng)解剖學證實,延髓腹外側(cè)部有豐富的兒茶酚胺能神經(jīng)元,并接受來自下丘腦、藍斑、孤束核等與水鈉平衡相關(guān)腦區(qū)的纖維投射[5]。但延髓腹外側(cè)部的兒茶酚胺能神經(jīng)元是否參與腦膽堿能刺激引起的促鈉排泄反應,迄今為止尚未見報道。

另有文獻報道,中樞給予血管緊張素Ⅱ可引起升壓、飲水及促鈉排泄反應[6-7];腦血管緊張素能AT1受體參與大鼠腦室高張刺激引起的腎排鈉量、排鉀量、尿量增加和平均動脈壓升高的效應[6,8],但腦血管緊張素能 AT1受體是否參與側(cè)腦室給予氨甲酰膽堿引起的延髓腹外側(cè)部兒茶酚胺能神經(jīng)元活性變化的反應目前尚未見報道。酪氨酸羥化酶 (thyrosine hydroxylase,TH)是兒茶酚胺合成的限速酶,可作為兒茶酚胺能神經(jīng)元活性的標志[5]。本研究應用整體實驗和免疫組織化學的方法,觀察側(cè)腦室注射膽堿能激動劑氨甲酰膽堿 0.5μg后對腎排鈉量、腎小球濾過率 (glomerular filtratior rate,GFR)和腎血漿流量 (renal plasma flow,RPF)的影響,延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應活性的變化,以及用氯沙坦 (20μg)阻斷腦血管緊張素能 AT1受體后對上述變化的影響;探討中樞兒茶酚胺能神經(jīng)元和血管緊張素能神經(jīng)元在腦膽堿能刺激引起的促鈉排泄反應中的作用機制及可能的相互關(guān)系,為進一步研究腎排鈉障礙的中樞機制,揭示其在高血壓發(fā)生發(fā)展中的可能影響提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑和儀器 氯沙坦 (losartan,Los)、氨甲酰膽堿 (carbachol,CBC)、TH一抗、二氨基聯(lián)苯胺、菊粉、對氨基馬尿酸為美國Sigma公司產(chǎn)品,其他免疫組化試劑為武漢博士德公司產(chǎn)品或國產(chǎn)分析醇。XY-86型振動切片機 (浙江象山科學精密儀器廠),Easylyte plus Na/K/Cl分析儀 (美國 Medica公司 ),Olympus A.H-B-L萬用顯微鏡 (日本),754型分光光度計 (日本),M IAS-GOODJJ.BMP圖像分析儀 (美國)。

1.2 動物分組 36只健康雄性 SD大鼠于一側(cè)腦室埋置導管,1周后將動物隨機均分為 4組 (n=9),①NS+NS組：側(cè)腦室先注射 0.85%NaCl 5μl,20 min后再注射 0.85%NaCl 5μl;②NS+CBC組：側(cè)腦室先注射 0.85%NaCl 5 μl,20 min后再注射 0.5μg氨甲酰膽堿 5μl;③Los+CBC組：側(cè)腦室先注射 20μg氯沙坦 5 μl,20 min后再注射 0.5μg氨甲酰膽堿 5μl;④Los+NS組：側(cè)腦室先注射 20μg氯沙坦 5 μl,20 min后再注射 0.85%NaCl 5μl。所有動物均由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.3 整體實驗 實驗時各組大鼠麻醉后固定,行氣管插管、膀胱插管,分離頸外靜脈供輸液,分離頸總動脈供取血、監(jiān)測血壓。每 20 min收集尿樣本 1次,用 Easylyte p lus Na/K/Cl分析儀測定尿鈉濃度。

1.3.1 腎小球濾過率 (GFR)的測定 頸外靜脈輸注菊粉后,分別于側(cè)腦室注射前 30 min,注射后 30 min和 50 min取血、尿樣本。用分光光度計測定腎菊粉的清除率。

1.3.2 腎血漿流量 (RPF)的測定 頸外靜脈輸注對氨基馬尿酸后,分別于側(cè)腦室注射前 30 min,注射后 30 min和 50 min取血、尿樣本。用分光光度計測定腎對氨基馬尿酸的清除率。

1.4 免疫組織化學實驗 側(cè)腦室注藥后 40 min,麻醉經(jīng)心臟灌流,取腦后固定。用振動切片機切取 50μm厚冠狀腦片,按 George Paxinos&Charles Watson腦立體定位圖譜[8],用中性紅染色在低倍鏡下挑選前囟后 11.3～14.08 mm(Bregma：-11.3 mm～ -4.08 mm)部位的腦片即為延髓腹外側(cè)部所在部位,進行免疫組織化學實驗。①2%Triton孵育 5 min,PBS振蕩漂洗;②2%BSA孵育 40 min;③小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶一抗 (1∶2 000)4℃孵育過夜;④PBS漂洗,2%的 BSA孵育 30 min;⑤生物素化的二抗室溫孵育 1 h,PBS漂洗;⑥ SABC室溫孵育 30 min,PBS漂洗;⑦二氨基聯(lián)苯胺顯色;⑧二甲苯透明,中性樹膠封片;⑨光鏡下觀察酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元的數(shù)目及免疫染色強度并拍片。

1.5 圖像分析和統(tǒng)計學分析 選取 NS+NS組、NS+CBC組、Los+CBC組和 Los+NS組大鼠各 6只,用 M IAS-GOODJJ.BMP圖像分析系統(tǒng)對延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元的個數(shù)和平均光密度進行測定。

1.6 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)用 SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理,實驗指標用均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示,4組間進行單因素方差分析,并進行SNK兩兩比較,以 P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 氯沙坦對側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿引起的促鈉排泄作用的影響 各組間腎排鈉量指標經(jīng)方差分析有顯著性統(tǒng)計學差異 (F=10.194,P＜0.05)。圖 1顯示：NS+NS組大鼠注藥后120 min排鈉量基本穩(wěn)定于注藥前水平。NS+CBC組大鼠注藥后排鈉量明顯增加,40 min達到高峰,與 NS+NS組相比,兩組注射前排鈉量無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05);注射后 21～40 min排鈉量明顯高于 NS+NS組,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。Los+CBC組注射后排鈉量也顯著增加,但與 NS+CBC組相比,兩組注射前排鈉量無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05);注射后 21～40min內(nèi)排鈉量明顯低于 NS+CBC組,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。Los+CBC組與 NS+NS組相比,注射前排鈉量無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05);注射后 21～40min內(nèi)排鈉量仍高于 NS+NS組,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。

圖1 氯沙坦對側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿引起的促鈉排泄的影響Fig.1 Effect of losartan pretreatment on carbachol-induced natriuresis

2.2 側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿和/或氯沙坦對腎小球濾過率和腎血漿流量的影響 各組間腎小球濾過率指標經(jīng)方差分析無統(tǒng)計學差異 (F=1.157,P＞0.05)。表 1顯示：NS+NS組大鼠注藥后 30min和 50minGFR基本穩(wěn)定于注藥前水平。NS+CBC組大鼠 GFR注藥后與注藥前相比無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05),與 NS+NS組相比,注藥后 30min和 50minGFR也無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。Los+CBC組大鼠注藥后 30min和 50minGFR,與 NS+CBC組及 NS+NS組相比均無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。Los+NS組大鼠注藥后 GFR基本穩(wěn)定于注藥前水平,與 NS+NS組相比也無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。

4組腎血漿流量指標經(jīng)方差分析無統(tǒng)計學差異 (F=1.96,P＞0.05,表 2)。而且 RPF的變化規(guī)律與 GFR的相似。

表1 側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿及氯沙坦對腎小球濾過率的影響Table1 Effect of carbachol and /or losartan on glomerular filtration rate(ˉx±s)

表2 側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿及氯沙坦對腎血漿流量的影響Table2 Effect of carbacol and /or losartan on renal plasma flow(ˉx±s)

2.3 氯沙坦對側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿引起的延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應活性變化的影響 本研究以延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元的數(shù)目和平均光密度作為酪氨酸羥化酶免疫反應強度的評價指標。側(cè)腦室注藥后各組間陽性神經(jīng)元的數(shù)目經(jīng)方差分析有顯著性統(tǒng)計學差異 (F=3.924,P=0.024),陽性神經(jīng)元平均光密度指標經(jīng)方差分析也有顯著性統(tǒng)計學差異 (F=4.596,P=0.013)。NS+NS組大鼠延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元散在分布,細胞形態(tài)不清晰,染色較淺 (圖 2C)。與 NS+NS組相比,NS+CBC組大鼠延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元密集分布,胞漿深染,細胞輪廓清晰(圖 2A),免疫染色強度明顯增強 (表 3,P＜0.05)。與 NS+CBC組相比,Los+CBC組大鼠延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,散在分布,胞漿染色較淺,但細胞形態(tài)清晰 (圖 2B),免疫染色強度明顯降低(表 3,P ＜0.05)。Los+NS組與 NS+NS組相比免疫反應陽性顆粒數(shù)目和免疫染色強度無統(tǒng)計學差異 (圖 2、表 3,P ＞0.05)。

圖2 氯沙坦對側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿引起的延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫陽性反應變化的影響Fig.2 Effect of losartan on the changes of TH-IR in RVL induced by ICV injection of carbachol

3 討 論

研究表明,腦中樞參與腎鈉水排出的調(diào)節(jié),下丘腦、藍斑 (locus coeruleus,LC)給予膽堿能刺激可引起動物攝水、平均動脈壓升高和腎的鈉排泄反應增加[2-3]。本研究結(jié)果顯示：大鼠側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿 (0.1、0.2、0.5μg)也可引起腎排鈉增加,并且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。這表明腎的鈉排泄直接受到中樞膽堿能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。注射 0.5μg氨甲酰膽堿后動脈血壓迅速升高,20 min后基本恢復,而腎排鈉量增加持續(xù) 100 min,這表明血壓升高不是側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿引起持續(xù)性促鈉排泄反應的主要因素,可能有其他神經(jīng)體液因素參與這種促鈉排泄反應。有研究報道[9],用正常犬血量擴張后的血液,灌流游離腎,尿鈉排出量顯著增加;而用去頭犬血量擴張后的血液,灌流游離腎,則不引起尿鈉排出量增加的反應。這提示腦中樞在調(diào)控腎促鈉排泄反應中是重要的參與者。

本實驗還發(fā)現(xiàn),側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿和 /或氯沙坦后,大鼠的腎小球濾過率和腎血漿流量均無明顯改變,進一步表明,腦膽堿能刺激引起的促鈉排泄反應不是通過改變腎血流動力學來實現(xiàn)的,可能是中樞通過神經(jīng)體液機制作用于腎小管引起的。有研究發(fā)現(xiàn),膽堿能刺激大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)等核團引起的促鈉排泄反應與腎神經(jīng)活動改變無關(guān),與血壓升高、腎小球濾過率和腎血漿流量的改變也無關(guān),可能與某些體液因子有關(guān)[10]。Baldissera[10-11]發(fā)現(xiàn),膽堿能刺激第三腦室前腹部在引起腎鈉鉀水排出增加的同時伴有血漿心房鈉尿肽水平的升高,垂體和下丘腦內(nèi)側(cè)區(qū)的心房鈉尿肽也有增高;損毀第三腦室前腹部后上述腦區(qū)心房鈉尿肽水平降低,并且血漿心房鈉尿肽含量明顯降低。上述研究提示,腦區(qū)的心房鈉尿肽能神經(jīng)元參與了腦膽堿能刺激引起的血漿心房鈉尿肽升高的反應,腦膽堿能刺激引起的促鈉排泄反應與中樞的心房鈉尿肽的釋放有關(guān)。

另研究發(fā)現(xiàn),側(cè)腦室給予腎上腺素可引起與上述相似的促鈉排泄反應[3],提示腦膽堿能刺激和腦兒茶酚胺能刺激引起的促鈉排泄反應很可能具有或部分具有共同的神經(jīng)傳導通路。本實驗觀察到,側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿后 40 min,延髓腹外側(cè)部酪氨酸羥化酶免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,免疫染色強度明顯增強。這表明延髓腹外側(cè)部不僅參與應激、防御時交感緊張性沖動和心血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)控,而且參與機體水鈉代謝的調(diào)節(jié)。飲食中鈉攝入增加可引起延髓腹外側(cè)部心血管反應增強[12],提示延髓腹外側(cè)部通過調(diào)節(jié)水鈉代謝從而影響心血管活動。免疫組織化學證實,血管緊張素能 AT1受體在許多腦區(qū)如藍斑、孤束核、延髓腹外側(cè)部的分布與兒茶酚胺能神經(jīng)元的分布有顯著的重疊性[13],提示腦血管緊張素能神經(jīng)通路與腦兒茶酚胺能神經(jīng)通路在功能上可能具有密切聯(lián)系。本實驗還發(fā)現(xiàn)：選用腦血管緊張素能 AT1受體拮抗劑氯沙坦預處理后,可明顯減弱氨甲酰膽堿誘導的延髓腹外側(cè)部兒茶酚胺能神經(jīng)元活性的變化,表明內(nèi)源性的血管緊張素Ⅱ作用于AT1受體后,可能通過或部分通過影響兒茶酚胺能神經(jīng)元的活性,參與側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿引起的促鈉排泄反應。本實驗結(jié)果結(jié)合文獻報道[14],推測側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿后,可能引起內(nèi)源性血管緊張素Ⅱ的釋放,作用于延髓腹外側(cè)部的 AT1受體,引起延髓腹外側(cè)部兒茶酚胺能神經(jīng)元興奮,釋放兒茶酚胺,后者作為神經(jīng)遞質(zhì),通過某種神經(jīng)液遞機制引起腎臟的促鈉排泄反應。

近幾年的研究都在探討中樞血管緊張素Ⅱ增強兒茶酚胺能神經(jīng)元活性的機制,包括促進兒茶酚胺類遞質(zhì)的合成、釋放以及轉(zhuǎn)運體的活動。有文獻報道,腦兒茶酚胺能神經(jīng)元參與中樞給予血管緊張素Ⅱ引起的升壓和飲水反應,其作用機制可能是通過血管緊張素Ⅱ作用于α-腎上腺素能受體或血管緊張素能 AT1受體,引起下丘腦去甲腎上腺素釋放量明顯增多,并呈顯著的量效關(guān)系[15]。另研究發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅱ可激活磷脂酶 C和蛋白激酶 C傳導通路,促進腎上腺素轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的活動[14]或增強酪氨酸羥化酶 mRNA、c-fos的表達[16],引起腎上腺素合成和釋放增加。

綜上所述,腦血管緊張素能通路和腦兒茶酚胺能神經(jīng)通路共同參與側(cè)腦室注射氨甲酰膽堿引起的腎促鈉排泄反應。但其確切的細胞及分子生理機制還有待進一步的研究。

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Effect of AT1receptor on changes of thyrosine hydroxylase-immunoreactivity in rostral ven trolateral medulla induced by bra in cholinergic stimuli in rats

WANGM in1,YAO Qi-ying2,XIA Man-li1,ZHOU Xin-mei1,JIANG Chun-ling2
(1.Department of Physiology,Jiaxing University,School of Medicine,Jiaxing 314001,China;2.Department of Physiology,Dalian Medical University,Dalian 116027,Chian)

Objective：To investigate the effect of AT1receptor on the changes of thyro sine hydroxylase-immunoreactivity(TH-IR)in rostral ventrolateral medulla(RVLM)induced by brain cholinergic stimuli in rats.Methods：Male SD rats were randomly divided into 4 groups：NS+CBCgroup,Los+CBC group,Los+NS group and NS+NS group.AT1was blocked by pretreatment of 20μg losartan in Los+CBC and Los+NS groups;intracerebroventricular injection of 0.5μgcarbachol was used for cholinergic stimuli in NS+CBC and Los+CBC groups;normal saline(NS)was used for control.The output amount of natrium in kidney,glomerular filtration rate(GFR)and renal plasma flow(PRF)were observed.The changes of TH-IR in the RVLM were observed by immunohistochemistry.Results：In NS+CBC group carbachol induced potent natriuresis,after pretreatment of losartan the natriuretic effectwas partially inhibited in Los+CBC group.Both the number and op tical density of THIR positive neurons in NS+CBC group were markedly increased than those in NS+NS group(P＜0.05);while those in Los+CBC group were significantly lower than those in NS+CBC group(P＜0.05).Intracerebroventricular injection of carbachol and losartan had no effect on GFR and RPF(P＞0.05).Conclusion：The results suggest that cholinergic stimuli can induce potent natriuresis and increase the activity of adrenergic neurons in the RVLM;the above effects can be down regulated by blockade of brain AT1recep tor.

Carbachol/pharmacol;Recep tor,angiotensin,Type 1/pharmacol;Medulla oblongata/drug eff;Losartan/pharmacol

R 334

A

1008-9292(2011)01-0071-07

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2011.01.013

2010-05-26

2010-11-24

浙江省嘉興市科技局項目 (2008AY2039-4).

王 敏 (1979-),女,碩士 ,講師;E-mail：wmwmwmtom@yahoo.com.cn

姜春玲 (1964-),女,教授,博導;主要從事神經(jīng)和腎臟生理研究;E-mail：chunling_jiang2006@yahoo.com.cn

[責任編輯 黃曉花 ]