趙春華 侯倩慧 余季金

(青島華測檢測技術(shù)有限公司，青島 266101) (青島普仁儀器有限公司，青島 266046) (青島大學，青島 266071)

對辣椒或其提取物中辣椒素類物質(zhì)的定量分析可采用鋁藍比色法、辣椒素分光光度法、高效液相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法、液-質(zhì)聯(lián)用法等多種方法。經(jīng)對比可知，傳統(tǒng)方法成本低，但準確度不夠理想?，F(xiàn)代高檔儀器分析法的靈敏度和準確度都較高，但儀器價格昂貴。目前普及的液相色譜因其性價比優(yōu)越和方法可靠常被用于此項工作，但分析速度還有待進一步提高。

筆者采用的超高效液相色譜法有效地解決了上述問題，不但樣品前處理較簡單，而且實現(xiàn)了3種主要辣味成分在3 min內(nèi)良好地分離，定性、定量準確。此法適用于辣椒及辣椒制品辣味水平的快速、準確測量評價。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：ACQUITYTMUtra Performance LC型，配二元高壓泵、二極管陣列檢測器，美國Waters公司;

辣椒素(C)：純度為98%，于(20±4)℃條件下儲存，國家標準物質(zhì)中心;

二氫辣椒素(DHC)：純度為98%，于(20±4)℃條件下儲存，國家標準物質(zhì)研究中心;

甲醇：色譜純，美國Teda公司；

酸性氧化鋁：74～150 μm(100～200目)，上海晶純試劑有限公司;

其它試劑為分析純。

1.2 標準溶液配制

準確稱取辣椒素和二氫辣椒素標準品0.010 g(折算為純品)，用甲醇溶解準確定容至10 mL,配制成l g/L的標準貯備液，再用甲醇逐漸稀釋分別得到0、1.0、10.0、30.0、50.0、70.0、100.0 mg/L的系列標準溶液。

1.3 樣品前處理

將干辣椒樣品用電動粉碎機粉碎,過0.391 mm篩。稱取粉碎后樣品1.0 g(精確到0.001 g)于50 mL離心管內(nèi)，加入1.0 g酸性氧化鋁粉，準確加入四氫呋喃-甲醇(體積比1∶1)溶液10 mL，渦旋，震蕩1 min,再超聲提取30 min。取出冷卻至室溫，移取100 μL用甲醇稀釋10倍(可根據(jù)樣品中辣素含量確定適當?shù)南♂尡稊?shù)),混勻，過0.22 μm濾膜備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)；柱溫：40℃；流動相：A為水，B為乙腈,流速為0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.5 定量測定

取系列標準溶液各進樣3 μL，以濃度-峰面積繪制標準曲線(或取跟樣品濃度相近的標準溶液進行單點校正)，以保留時間和該點處的光譜圖定性，峰面積定量。降二氫辣椒素(NDHC)與辣椒素共用同一條標準曲線。以斯科維爾指數(shù)(SHU)計,辣椒素同系物總量x按式(1)計算：

(1)

式中：V——定容體積，mL；

m——取樣量，g；

ρNDHC——降二氫辣椒素質(zhì)量濃度，mg/L；

ρC——辣椒素質(zhì)量濃度，mg/L；

ρDHC——二氫辣椒素質(zhì)量濃度，mg/L；

9 300、16 100——斯科維爾指數(shù)(SHU)換算系數(shù)。

圖1、圖2分別為0.01 mg/L的標準色譜圖和樣品色譜圖。

圖1 標準色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相及去甲二氫辣椒素色譜峰的確認

通過對常用洗脫溶劑甲醇、乙腈、水以及流動相pH值等條件的優(yōu)化，確定了最佳洗脫條件，見1.4色譜條件。從C的主峰分出一明顯的小峰(1.415 min)，且該峰與C、DHC的峰面積比為1∶3∶6，基本符合辣椒中辣椒素同系物各組分含量的比例。該處的光譜圖和1.587 min(C)及2.197 min(DHC)處的光譜圖完全一樣。由此可斷定該峰為NDHC，理論上可以用辣椒素的標準曲線定量分析降二氫辣椒素。

2.2 檢測波長的確定

從圖2標準的光譜圖可以看出C和DHC 的紫外全波長掃描圖完全一致。在230 nm和280 nm 處出現(xiàn)兩個吸收峰，230 nm 比280 nm 的吸收值高很多且峰形平緩，作為檢測波長將更靈敏。但在短波長范圍內(nèi)有紫外吸收的物質(zhì)越多，就越容易產(chǎn)生干擾。在280 nm處儀器的靈敏度已經(jīng)滿足測試要求，故采用280 nm處進行定量。

2.3 不同提取劑提取效果的比較

分別采用乙睛、飽和乙睛、四氫呋喃-甲醇(體積比1∶1)、甲醇、50%的甲醇水超聲提取，試驗發(fā)現(xiàn),四氫呋喃-甲醇(體積比1∶1)的提取效果最好。

2.4 不同凈化效果的比較

考慮使用石墨化碳和酸性氧化鋁凈化提取物里面的色素和油脂。凈化后和凈化前疊加色譜圖如圖3所示。

圖3 疊加色譜圖

從圖3可以看出，使用酸性氧化鋁粉使得樣品前面很大的雜質(zhì)峰得到很大程度的凈化，而目標物C和DHC并沒有明顯損失。使用石墨化碳似乎已經(jīng)除掉很多色素，但其前面的色譜雜質(zhì)峰并沒有很多變化，凈化效果不理想。

2.5 檢出限和定量限

對逐步稀釋的標準溶液進行分析，以3倍信噪比(S/N)計算檢出限，10倍信噪比為定量限。辣椒素、二氫辣椒素的檢出限為0.05 mg/mL，定量限為0.25 mg/mL。

2.6 標準曲線方程

以6個濃度(1.0、10.0、30.0、50.0、70.0、100.0 mg/mL)水平繪制標準曲線，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標作校正曲線并進行線性回歸。C的標準曲線回歸方程為Y=7 690X+14 000，r=0.999 6；DHC的標準曲線回歸方程為Y=7 010X+13 500,r=0.999 7。結(jié)果表明，C和DHC在1.0～100.0 mL/L濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.7 回收試驗

稱取已知量的供試品1.0 g，共9份，每3份為一組，分別加入低、高濃度水平的標準貯備液。按1.3 進行樣品前處理，分別進樣并計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 C和DHC回收試驗結(jié)果

由表2可知，C和DHC的回收率分別為93.0%～100.0%、92.9%～97.4%。

2.8 精密度試驗

取10.0 mg/L的標準溶液和樣品制備溶液，按1.4色譜條件，分別連續(xù)進樣5次，進行精密度試驗。辣椒素、二氫辣椒素測定結(jié)果的相對標準偏差分別為0.8%、1.2%(n=5)。

3 結(jié)語

建立了用甲醇-四氫呋喃(體積比1∶1)混合溶液作提取溶劑，超聲波法提取辣椒素，采用超高效液相色譜法測定辣椒素的方法。此方法具有簡便快捷、準確度好、靈敏度高等特點。

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