黃海龍 莊 莉 崔 群 孫偉強(qiáng)

(桐鄉(xiāng)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，桐鄉(xiāng) 314500) (桐鄉(xiāng)市計(jì)量檢定測試所，桐鄉(xiāng) 314500)

高效液相色譜(HPLC)是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分析分離技術(shù),它是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，采用高壓輸送流動相和高靈敏度檢測器,發(fā)展而成的現(xiàn)代液相色譜分析方法, 具有分離效率高、選擇性好、分析速度快、檢測靈敏度高、操作自動化高和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[1]。

近年來，由于消費(fèi)者對食品的安全性日益關(guān)注，食品中的各種添加劑越來越受到人們的重視。食品添加劑是指為了改善食品品質(zhì)和色、香、味，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的化學(xué)合成或天然物質(zhì)。在目前所使用的添加劑中，絕大多數(shù)為化學(xué)合成添加劑，它們是通過氧化、還原、縮合等一系列化學(xué)合成反應(yīng)所得，有的具有一定毒性，有的在食品中起變態(tài)反應(yīng)或轉(zhuǎn)化成其它有毒物質(zhì)。通過動物實(shí)驗(yàn)證明，有些物質(zhì)有致癌、致畸形等作用，如果不加以限制使用，將對人體健康產(chǎn)生危害。

高效液相色譜具備分離效果好、靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),因此是目前食品添加劑定性、定量分析的首選方法[2]。筆者采用甲醇-乙酸銨 (0.02 mol/L)為流動相經(jīng)梯度淋洗,能在25 min內(nèi)將榨菜中的合成著色劑[3]、防腐劑[4,5]、甜味劑[6]等完全分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1100 型，美國安捷倫公司；

紫外可見光檢測器：UV-2102PC型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

pH計(jì)：Delta 320型，瑞士梅特勒托利多科學(xué)儀器有限公司；

超聲清洗機(jī)：CQ250型，上海申浦超聲設(shè)備廠；

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、糖精鈉、乙?；前匪徕?安賽蜜)、天門冬酰苯丙胺酸甲酯(阿斯巴甜)、檸檬黃、日落黃濃度均為1 mg/mL；

標(biāo)準(zhǔn)混合液：取各組分標(biāo)準(zhǔn)儲備液各0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，混合均勻后定容至10 mL，得到0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，備用。

1.2 樣品處理

選擇市售本地和外地產(chǎn)榨菜3種(胖子榨菜、航空小菜、烏江三榨)整包帶汁切碎勻漿后,取樣10 g左右裝入125 mL三角燒杯中,加入5 mL 10 g/L乙酸鋅溶液、50 mL蒸餾水混和均勻后超聲波提取15 min，經(jīng)中速定性濾紙過濾至100 mL容量瓶中,用氨水溶液(1+9)調(diào)節(jié)至pH 6.0,以蒸餾水定容至100 mL，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后，供上機(jī)測定。

1.3 色譜條件

C18柱顆粒度：5 μm；柱溫：30℃；檢測波長：230 nm；流動相：甲醇-乙酸銨(0.02 mol/L)，體積比35∶65，pH 6.0，流速為1.0 mL/min；自動進(jìn)樣器進(jìn)樣量：5 μL；以保留時(shí)間定性，面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長選擇

在200～300 nm范圍內(nèi),用紫外-可見光分光光度計(jì)檢測山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、乙?；前匪徕洝⑻扉T冬酰苯丙胺酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、脫氫乙酸、檸檬黃、日落黃10種物質(zhì),發(fā)現(xiàn)其敏感波長分別大致為260、229、202、226、254、254、254、231、257、234 nm。兼顧10種組分在200～300 nm的紫外吸收值，其中有4種物質(zhì)的吸收峰值在230 nm附近,因此選擇230 nm為起始檢測波長，后期利用可變波長檢測器的波長切換功能將掃描波長變更為254 nm，以達(dá)到不同波長吸收范圍的物質(zhì)都能有較大響應(yīng)值[7]。

2.2 流動相選擇

以甲醇-乙酸銨(0.02 mol/L)體積比為5∶95,pH 7,作為流動相對組分進(jìn)行分離,結(jié)果如圖1。

0—溶劑; 1—乙?；前匪徕?； 2—苯甲酸； 3—山梨酸； 4—糖精鈉； 5—脫氫乙酸； 6—檸檬黃； 7—天門冬酰苯丙胺酸甲酯； 8—日落黃；9—對羥基苯甲酸乙酯； 10—對羥基苯甲酸丙酯圖1 添加劑組分分離圖A

由圖1可見，有3種組分(脫氫乙酸、檸檬黃、天門冬酰苯丙胺酸甲酯)的出峰時(shí)間集中在10～12 min內(nèi)，脫氫乙酸峰拖尾，三者未完全分離。另外，只有9種物質(zhì)能找到對應(yīng)的峰，對羥基苯甲酸丙酯在此條件下的柱內(nèi)保留性較強(qiáng)，出峰時(shí)間在35 min以后，不利于高效檢測。因此采用梯度淋洗，后期加強(qiáng)洗脫強(qiáng)度，縮短分析時(shí)間[8]。

針對實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)脫氫乙酸峰形有拖尾現(xiàn)象，分析其原因?yàn)槊摎湟宜岜旧順O性較強(qiáng)，流動相在pH 7.0時(shí)極性相對偏弱，因此考慮降低流動相pH值，提高極性以改善脫氫乙酸的拖尾問題。經(jīng)多次調(diào)整試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將乙酸銨溶液酸度調(diào)至pH 6.0時(shí)脫氫乙酸拖尾即有明顯改善。

采用0～10 min，甲醇-乙酸銨體積比為95∶5，10～30 min，甲醇-乙酸銨體積比為45∶55的梯度淋洗模式后，對羥基苯甲酸丙酯在26 min左右出峰，如圖2所示。10種測定目標(biāo)物均能在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離,但是由于檸檬黃在波長230 nm處的吸收較弱，響應(yīng)偏低，因此在其出峰前將測定波長調(diào)整至254 nm,并將后期甲醇-乙酸銨流動相比例進(jìn)一步調(diào)整為50∶50，得到如圖3的分離圖。

通過對流動相比例調(diào)整、梯度安排、pH值調(diào)節(jié)，并利用可變波長檢測器的特征對檢測過程中不同波長的選擇試驗(yàn)，最終采用梯度淋洗模式：0～10 min內(nèi)，甲醇-乙酸銨體積比5∶95；10～30 min內(nèi)，甲醇-乙酸銨體積比50∶50。檢測器用變波長掃描：0～13 min內(nèi)，波長為230 nm；13～30 min內(nèi)，波長為254 nm。儀器最佳條件:乙酸銨酸度為pH 6.0，柱溫30℃，流速1 mL/min。

0—溶劑; 1—乙酰磺胺酸鉀； 2—苯甲酸； 3—山梨酸； 4—糖精鈉； 5—脫氫乙酸； 6—檸檬黃；7—天門冬酰苯丙胺酸甲酯； 8—日落黃；9—對羥基苯甲酸乙酯； 10—對羥基苯甲酸丙酯
圖2 添加劑組分分離圖B

0—溶劑; 1—乙酰磺胺酸鉀； 2—苯甲酸； 3—山梨酸； 4—糖精鈉； 5—脫氫乙酸； 6—檸檬黃； 7—天門冬酰苯丙胺酸甲酯； 8—日落黃；9—對羥基苯甲酸乙酯； 10—對羥基苯甲酸丙酯
圖3 添加劑組分分離圖C

2.3 工作曲線

對配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)混合使用溶液進(jìn)行測定，以濃度X(μg/mL)對相應(yīng)的面積Y作外標(biāo)曲線,回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一空白樣品平行試樣3份,分別加入等量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品提取液中各組分的濃度均為0.02 mg/mL,按1.2方法處理后測定其中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、糖精鈉、乙酰磺胺酸鉀(安賽蜜)、天門冬酰苯丙胺酸甲酯(阿斯巴甜)、檸檬黃、日落黃的含量,結(jié)果見表2。由表2可見，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～3.3%，表明方法的精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取榨菜樣品10.0 g置于125 mL錐形瓶中，按本實(shí)驗(yàn)方法處理及測定(n=3)，然后進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可見，回收率為96.6%～99.4%，表明方法的準(zhǔn)確度較好。

3 結(jié)語

采用HPLC法同時(shí)測定榨菜中防腐劑、甜味劑、合成著色劑殘留量，其重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度較高，同時(shí)操作簡便、快捷，能在30 min 內(nèi)將10種添加劑基本分離，達(dá)到日常測定樣品的要求。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果

[1] 張曉彤.液相色譜檢測方法[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：6-44.

[2] 于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：288-296.

[3] GB/T 5009.35-2003 食品中合成著色劑的測定[S].

[4] GB/T 23377-2009 食品中脫氫乙酸的測定 高效液相色譜法[S].

[5] GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定 高效液相色譜法[S]

[6] GB/T 22254-2008 食品中阿斯巴甜的測定[S].

[7] 張秀堯.反相高效液相色譜法同時(shí)快速測定食品中常見的8種食品添加劑[J].色譜，2000,18(6):539-542.

[8] 王亞平，周勇，黃鸝，等.高效液相色譜法同時(shí)測定醬腌菜中6種對羥基苯甲酸酯[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008,27(4):425-429.