李艷彩，李元軍，黃富英，王 飛，王水金

(漳州師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，福建 漳州 363000)

肌紅蛋白位于肌肉的肌細(xì)胞中，其功能是可逆地結(jié)合氧氣，將氧氣貯存于肌肉細(xì)胞中.從結(jié)構(gòu)上來看，Mb以血紅素作為活性中心，與一些以血紅素為輔基的酶 (如辣根過氧物酶、 細(xì)胞色素等 )的結(jié)構(gòu)相似，含有一個供底物結(jié)合的空缺配位點.因此Mb常作為研究酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的模型化合物.Mb表現(xiàn)出的生理功能及參與的代謝過程，大多數(shù)涉及電子傳遞過程.因此用電化學(xué)方法研究Mb的氧化還原反應(yīng)及類酶性質(zhì)，具有得天獨厚的優(yōu)勢.同時，Mb由于相對便宜易得，是研究血紅素蛋白質(zhì)和酶的電子傳遞反應(yīng)的理想模型物.但由于Mb與固體電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移速率較緩慢，不得不借助于媒介體或促進(jìn)劑[1-2]進(jìn)行研究.Rusling等[3-4]報道，在涂布于熱解石墨(PG)電極上的表面活性劑薄膜中，Mb與電極之間的電子傳遞可大大加速，這為研究蛋白質(zhì)在模擬生物膜中的直接電化學(xué)提出了一個新思路.

碳納米管(CNTs)的中空管狀結(jié)構(gòu)、大長徑比、高機械韌性及良好的導(dǎo)電性為其在電化學(xué)和電分析化學(xué)中的廣泛應(yīng)用奠定了基石[5-7].研究表明，CNTs產(chǎn)品的不同預(yù)處理方法極大地影響其電化學(xué)性質(zhì)[8].此外，因為CNTs通常是一種相互纏繞的，找不到終端的線團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，管壁間因存在強的范德華力而極易發(fā)生團(tuán)聚且不溶于任何溶劑，這些都既不利于其在電極表面的修飾也不利于修飾后其優(yōu)點的發(fā)揮，所以人們往往采取各種辦法使之盡量能夠分散均勻.蔡稱心等[9]在1%(w)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)水溶液中得到了理想的 CNTs 分散液.CTAB屬于季銨鹽型陽離子表面活性劑.具有水溶性好，耐酸、耐堿和抗菌功效的特點，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、個人護(hù)理用品、消毒劑等方面.CTAB的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示，非極性區(qū)域含有正電荷[10].

以一種肌紅蛋白作為研究對象，通過CTAB利用CNTs直接把Mb固定到玻碳電極(GCE)表面.CTAB的存在能夠提供出一種快速有效地分散溶解單壁碳納米管的方法，并且更容易的將肌紅蛋白固定到SWCNTs表面.先前CTAB的生物相容性的表征將提供一種更好的微環(huán)境來保持蛋白的活性[11].本文希望通過SWCNTs-CTAB復(fù)合膜來更好地提高電極表面蛋白的直接電子轉(zhuǎn)移能力.文中已經(jīng)通過不同的電化學(xué)方法對復(fù)合膜中的肌紅蛋白進(jìn)行了表征，得到了一系列參數(shù).同時得到復(fù)合膜電極對NO2-的表現(xiàn)出良好的電催化活性，該制備方法簡便、廉價、可避免蛋白的失活.電極具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性.

1 實驗部分

1.1 試劑

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；肌紅蛋白(Mb)購于Sigma生物化學(xué)試劑有限公司；單壁碳納米管(Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs，純度超過95%)購自深圳納米港；亞硝酸鈉(30wt.%)購于天津市福晨化學(xué)試劑廠.0.1 mol/L不同pH值的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液是通過混合Na2HPO4和NaH2PO4的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入KCl作支持電解質(zhì)配制而得；其他所有化學(xué)試劑均為分析純試劑并未進(jìn)行進(jìn)一步處理；所有的溶液均用二次蒸餾水配制.

1.2 儀器設(shè)備及測試方法

KQ-50B型超聲波儀器清洗器；電化學(xué)實驗在CHI650C電化學(xué)工作站(CH Instrument，USA)上進(jìn)行.電化學(xué)池采用三電極系統(tǒng)：玻碳電極(3 mm直徑)為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl(3.0 mol/L KCl)電極為參比電極.實驗溫度為室溫(20±2)℃.循環(huán)伏安實驗在靜止的體系中進(jìn)行.所有溶液在電化學(xué)實驗前通氮氣20 min，并在實驗過程中保持氮氣保護(hù)氛圍，以消除溶液中溶解氧的影響.

1.3 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的制備

1.3.1 CTAB-Mb-SWCNTs試劑的制備 取50 mg CTAB溶解于5.00 mL蒸餾水中，超聲攪拌15 min，使其完全溶解，再取5 mg的SWCNTs作為分散劑，超聲15 min使其完全溶解，呈黑色均勻的液體.再稱取25 mg Mb超聲30 min使其完全溶解，得到CTAB-Mb-SWCNTs試劑，呈黑色均勻的液體.

1.3.2 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的修飾與測定 玻碳電極(3 mm直徑)依次用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3粉末打磨拋光，并在乙醇和蒸餾水中交替超聲清洗3次，用鐵氰化鉀檢測液檢驗電極可逆性，氮氣吹干待用.用微量注射器取18 μL滴到處理干凈的電極表面，置于冰箱中24 h.取pH 7.0磷酸緩沖溶液PBS，先沖氮氣20 min，實驗過程中保持氮氣保護(hù)氛圍，以消除溶液中溶解氧的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的直接電化學(xué)

圖1給出了不同電極在pH 7.0磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安對比圖.在所給電勢范圍內(nèi)觀察圖1a和c可知，在裸玻碳電極和CTAB-SWCNTs/GCE都沒有出現(xiàn)氧化還原峰.而CTAB-Mb/GCE修飾電極(圖1b)和CTAB-SWCNTs/Mb/GCE(圖1d)都有一對氧化還原峰.CTAB-SWCNTs/Mb/GCE循環(huán)伏安曲線上有一對峰形良好的且可逆的氧化還原峰，其峰電流比CTAB-Mb/GCE修飾電極的大得多.陰極峰和陽極峰電位分別為-0.192 V和-0.278 V，式電位Eθ′[Eθ′=(Ep,c+Ep,a)/2]為-0.235 V，該氧化還原峰應(yīng)歸于Mb的電活性中心血紅素的氧化還原[Mb-Fe(III)/Mb-Fe(II)].CTAB-SWCNTs/Mb/GCE在緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃過數(shù)圈后得到穩(wěn)態(tài)電流，所有關(guān)于膜電極的循環(huán)伏安測試都是在穩(wěn)態(tài)電流下進(jìn)行的.該膜電極之所以能很好地實現(xiàn)Mb的直接電子轉(zhuǎn)移主要是因為SWCNTs的納米尺寸效應(yīng)、電子結(jié)構(gòu)表面的拓?fù)淙毕?另外，SWCNTs的特性能增加了玻碳電極的有效面積.因此，很容易在CTAB和SWCNTs修飾的玻碳電極上得到肌紅蛋白的直接電子傳遞信號.

圖2是CTAB-SWCNTs/Mb/GCE不同掃速時在pH 7.0的磷酸緩沖溶液中測得的循環(huán)伏安圖.由圖3可知在10到500 mV/s掃速范圍內(nèi)，隨著掃速的不斷增大氧化峰電流和還原峰電流呈線性增大，但峰電位幾乎不隨掃速的增加而改變.氧化峰和還原峰與掃速之間的線性回歸方程分別為：Ipc(μA)=5.179+0.175 v(mV/s)(R=0.9981)； Ipa(μA)=-1.769-0.165 v(mV/s)(R=0.9988).這些結(jié)果表明該電極反應(yīng)是一個表面控制的單層電化學(xué)過程[12]，同時也說明了膜中所有的電活性[Mb-Fe(III)]在陰極掃描中全部被還原成[Mb-Fe(II)]，然后在反向陽極掃描中又全部轉(zhuǎn)化為[Mb-Fe(III)].結(jié)果充分表明SWCNTs-CTAB復(fù)合膜為實現(xiàn)電極上肌紅蛋白的直接電子轉(zhuǎn)移提供了一種合適的微環(huán)境.

2.2 不同電極在鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安圖

由圖4a可知，裸玻碳電極的循環(huán)伏安曲線峰峰電位差是0.079 V，說明裸玻碳電極具有良好的導(dǎo)電性.而CTAB-SWCNTs/Mb/GCE在鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安曲線的氧化峰電流和還原峰電流減少(見圖4b)，說明Mb在CTAB和SWCNTs的共同作用下，形成一層復(fù)合膜阻礙了鐵氰化鉀中Fe(III)的電子轉(zhuǎn)移.

圖3 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的陰極峰電流、陽極峰電流與掃速的關(guān)系曲線 圖4 裸玻碳電極(a)和CTAB-SWCNTs/Mb/GCE(b)在5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安曲線，掃速為200 mV/sFig 3 Relationship between scan rate and the anodic and cathodic peak current of CTAB-SWCNTs/Mb/GCEFig.4 Cyclic voltammograms of bare GCE (a) and CTAB-SWCNTs/Mb/GCE (b) in 5mmol/L Potassium ferricyanide solution at a scan rate of 200 mV/s

2.3 pH值對電極電位的影響

研究了支持電解質(zhì)溶液的pH值對CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的影響.圖5給出了緩沖溶液pH在5.0到9.0范圍內(nèi)CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的典型循環(huán)伏安曲線.隨著緩沖溶液pH的增大，膜電極的氧化峰和還原峰都負(fù)向移動，且循環(huán)伏安曲線峰形良好而穩(wěn)定.圖6A給出了式電位與pH的關(guān)系曲線，在pH4.0到9.0的范圍內(nèi)，[Mb Fe(III)]/[Mb Fe(II)]電對的式電位隨著pH值的變化而呈線性關(guān)系，斜率為-33.3 mV/pH.此斜率值比18.C下一個質(zhì)子參與的單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的理論值57.6 mV/pH要小的多.原因可能是反式配體的質(zhì)子化作用對血紅素周圍的鐵和氨基酸的影響，也可能是水分子與中心鐵之間的質(zhì)子化作用所致.所以，Mb與電極之間的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)可以簡單的用下式表達(dá)：

Mb-Fe(III)+H++e-?Mb-Fe(II)

圖6B是 pH值和還原峰電流I的關(guān)系曲線，還原峰電流隨pH的增大而增大，且在pH=7.0的時候，峰電流達(dá)到最大值.可知該體系反應(yīng)的最適宜pH為7.0.所以該實驗都是在pH 7.0的緩沖溶液中進(jìn)行的.

圖7 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE在NaNO2濃度分別為0 mM(a)、0.3 mM(b)、0.7 mM(c)、1.3 mM(d)和3.1 mM(e)溶液中的循環(huán)伏安曲線，掃速為200 mV/sFig.7 Cyclic voltammograms of CTAB-SWCNTs/Mb/GCE in 0.1 M solutions containing 0 mM (a), 0.3 mM (b), 0.7 mM (c), 1.3 mM (d) and 3.1 mM (e) NaNO2

圖5 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE在不同pH值( 5.0?6.0?7.0?8.0?9.0)的0.1mol/L 磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖,掃速為200 mV/s 圖6 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE中[Mb-Fe(Ⅲ)]/[Mb-Fe(Ⅱ)]電對的(A)式電位與溶液pH 值的關(guān)系曲線,(B)還原峰電流與溶液pH 值的關(guān)系曲線

Fig 5 Cyclic voltammograms of CTAB-SWCNTs /Mb /GCE in buffer solutions at different pH (5.0~9.0) values at a scan rate of 200 mV/s Fig．6 Relationship between Formal potential (A)and the anodic peak current(B)and pH of solution

2.4 NaNO2在CTAB-SWCNTs/Mb/GCE上的電催化還原

如圖7a，在pH 7.0的磷酸緩沖溶液中，CTAB-SWCNTs/Mb/GCE循環(huán)伏安圖僅僅顯示一對氧化還原峰，加入NaNO2后，該循環(huán)伏安曲線發(fā)生了明顯的變化，在-0.9V處的還原峰急劇增大.隨著NaNO2的增加，還原峰電流呈遞增的趨勢.而在-0.2 V處得氧化峰逐漸減小，還原峰逐漸增大.說明固定化的Mb對NaNO2的還原有明顯的電催化作用.這對亞硝酸鈉的檢測具有十分重要的意義.

2.5 CTAB-SWCNTs/Mb/GCE的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

通過檢測修飾電極儲存在冰箱中以后電流的大小變化來研究修飾電極的穩(wěn)定性.在-4℃下保存7 d后，電極沒有表現(xiàn)出明顯的電流減??；而保存三周以后仍然保持原有的電流響應(yīng)的92%.制備5根相同的電極，通過檢測電極對10 mM NaNO2的電流響應(yīng)來觀察電極的重現(xiàn)性.得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(R.S.D)為3.6%.傳感器的良好的穩(wěn)定性意味著十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)與單壁碳納米管(SWCNTs)具有良好的生物相容性并且適于固載肌紅蛋白.因此CTAB-SWCNTs能更好的吸附Mb實現(xiàn)電子傳遞，同時保持生物活性.

3 結(jié)論

本實驗通過CTAB-Mb-SWCNTs/GCE復(fù)合膜將血紅蛋白固載到玻碳電極表面，實現(xiàn)了Mb與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移，為氧化還原蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)研究提供了一種新的思路.該修飾電極對NaNO2的還原具有很好的催化響應(yīng)，可以作為檢測NaNO2的生物傳感器.該復(fù)合膜電極制備方法簡便易行，價格低廉，穩(wěn)定性好.

[1] Hanrahan K L,Macdonald S M, Roscoe S G.An electrochemical study of the interfacial and conformational behavior of cytochrome c and other heme proteins[J].Electrochim Acta,1996,41(15):2469-2479.

[2] King B C,Hawkridge F M J.A study of the electron transfer and oxygen binding reactions of myoglobin [J].Electroanal Chem,1987,237(1):81-92.為了增加讀寫的效率，在編寫讀寫地址模塊時盡量減少讀寫的切換，即保證連續(xù)的讀寫操作，這樣就可以保證最高的效率.在編寫地址模塊時，盡量保證每次讀寫的數(shù)據(jù)在同一行，這樣可以減少行之間的跳變，提高讀寫的效率，最理想的狀態(tài)是連續(xù)讀寫完每一行、每一塊的數(shù)據(jù)再換行換塊.本文基于FPGA所實現(xiàn)的SDRAM控制器具有較強的應(yīng)用價值.

參考文獻(xiàn):

[1] 田耘，徐文波.Xilinx FPGA開發(fā)實用教程[M].北京：清華大學(xué)出版社，2008:1-5.

[2] 何云斌，張玉芬.多端口SDRAM控制器的設(shè)計與實現(xiàn)[J].微計算機信息，2009，25(14)：49-71.

[3] Samsung.64Mb H-die(X32) SDRAM Specification[EB/OL].(2007-08-13)[2011-07-10].http://www.Samsung.com/global/business/semiconductor.

[4] 鄧可學(xué).隊列管理和SDRAM控制器的FPGA設(shè)計[R].南京:中國電子學(xué)會,2007:980-984.

[5] 薛小玲，劉志群，賈俊榮.單片機接口模塊應(yīng)用與開發(fā)實例詳解[M].北京：北京航空航天大學(xué)出版社，2010:35-110.

[6] 武文杰，劉皓，李少謙.基于FPGA的支持切換的Bank的SDRAM控制器設(shè)計[J].信息技術(shù)，2006，30(1)：33-36.

[7] 程方敏,黃啟俊,向守坤，等.基于FPGA的高速SDRAM控制器的視頻應(yīng)用[J].電子技術(shù),2009, 36(7):22-24.

[8] 徐洋，黃志宇，李彥，等.基于Verilog HDL的FPGA設(shè)計與工程應(yīng)用[M].北京：人民郵電出版社，2008:107-134.

[9] 黃智偉，王彥，陳文光,等.全國大學(xué)生電子設(shè)計訓(xùn)練教程[M].北京：電子工業(yè)出版社，2005:212-261.

[10] 李紹武.基于AVR單片機的風(fēng)能太陽能控制器設(shè)計[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2010,28(2):174-176.