胡振盛, 郭 佳, 陳 文, 莊 重,趙鐘鐘,2, 張 朝,2

1.江蘇省分子醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210046；2.江蘇省醫(yī)藥超分子材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210046

引言

電壓門控型鈉離子通道在神經(jīng)元、骨骼肌和心肌等可興奮組織的動(dòng)作電位產(chǎn)生過(guò)程中起著重要作用。在臨床上，鈉離子通道是多種藥物 (如麻醉劑、抗驚厥劑和抗心律失常藥)的作用靶點(diǎn)，其編碼基因突變將導(dǎo)致肌強(qiáng)直、心律不齊、癲癇等多種遺傳性鈉“通道病”(sodium"channelopathies")的發(fā)生[1～3]。

鈉離子通道的主要功能亞基α由一條肽鏈反復(fù)跨膜形成的4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)跨膜片段 (S1～S6)。其中，S4富含帶正電荷的側(cè)鏈氨基酸 (賴氨酸和精氨酸)，對(duì)膜的去極化敏感，是通道的電壓感受器 (voltage sensor)；S5與S6之間的連接肽段形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)半嵌入膜內(nèi)，被稱為P環(huán) (pore loop)[4～6]，在通道的通透性和離子選擇性中發(fā)揮著重要作用[7～9]。

氨基酸序列分析表明，由P環(huán)形成的鈉離子通道內(nèi)襯的外口結(jié)構(gòu)中，至少含有一套高度保守的負(fù)電氨基酸殘基環(huán)，由兩個(gè)谷氨酸 (E)和兩個(gè)天冬氨酸 (D)順序排列而成(圖1)[8,10]。Chiamvimonvat等[11,12]在研究大鼠骨骼肌鈉通道 (Nav1.4)的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，將上述4個(gè)氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?(C)，即中和側(cè)鏈的負(fù)電荷，會(huì)引起通道電導(dǎo)的顯著改變；有趣的是，跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅰ中的E403C突變，使單通道記錄的電流呈現(xiàn)獨(dú)特的反復(fù)振蕩現(xiàn)象 (flick)。Zhang等[13]在全細(xì)胞記錄模式下發(fā)現(xiàn)，E403C突變使鈉通道從失活狀態(tài)恢復(fù)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，用巰基修飾劑MTSES恢復(fù)E403側(cè)鏈的負(fù)電荷后，可以消除這種現(xiàn)象。

圖1 包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域(DⅠ～DⅣ)的電壓門控型鈉離子通道結(jié)構(gòu)示意圖 “E”和“D”表示通道外口處P環(huán)保守性負(fù)電荷側(cè)鏈的氨基酸殘基，“+”表示電壓感受器S4富含的正電荷側(cè)鏈氨基酸殘基Fig.1 A diagram of the structure of voltage-gated sodium channel containing 4 dom ains(DⅠ～DⅣ) "E" and"D"represent conservative negatively charged residues of P-loops in the outer mouth of sodium channel,"+" represents positively charged residues in voltage sensors

E403C突變對(duì)通道門控作用的影響是否的確由谷氨酸側(cè)鏈的負(fù)電荷被中和而引起？此部位負(fù)電荷的作用是否具有普遍性？為了回答這些問(wèn)題，我們采用基因定點(diǎn)突變、real-time PCR、Western blotting和全細(xì)胞膜片鉗等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，將人心肌鈉離子通道Nav1.5結(jié)構(gòu)域Ⅰ中P環(huán)375位高度保守的負(fù)電性谷氨酸殘基 (E375)，分別突變?yōu)殡娭行缘谋彼?(A)、正電性的賴氨酸 (K)和負(fù)電性的天冬氨酸 (D)，記錄了不同鈉通道突變體在人胚腎上皮細(xì)胞HEK293中表達(dá)后的全細(xì)胞電流，并對(duì)其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

含有人心肌鈉離子通道 α亞基 (Nav1.5，hH1)和β亞基 (hβ1)cDNA的質(zhì)粒pcDNA3.1-SCN5A和pcDNA3.1-SCN5B，由美國(guó)哥倫比亞大學(xué)藥理學(xué)系Robert S.Kass教授友好提供。含綠色熒光蛋白cDNA的質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP為本實(shí)驗(yàn)室所有。

使用的主要儀器有：HERACELL150i CO2培養(yǎng)箱 (Thermo Scientific，USA)，IX71熒光倒置顯微鏡 (Olympus，Japan)，TW 150-4微電極玻璃毛細(xì)管 (World Precision Instrument，USA)，P-97微電極拉制儀 (Sutter Instrument，USA)，Axopatch 200B膜片鉗放大器(Molecular Devices，USA)，以及Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器 (Molecular Devices，USA)。

鈉離子通道基因定點(diǎn)突變

將野生型鈉通道重組質(zhì)粒用Eco81I(TaKaRa)進(jìn)行酶切，得到包含E375位點(diǎn)的318 bp的片段，將其作為模板，用突變正向引物 (E375A：5'CCTGAGGGTCTGCTGATAGAGGCGCGCCCAGCAGT 3'；E375D：5'CCTGAGGGTCTGCTGATAGAGGCGGTCCCAGCAGT 3'；E375K：5'CCTGAGGGTCTGCTGATAGAGGCGCTTCCAGCAGT 3')和反向引物(5'CCTAAGGCACAAGTGCGTGCGCAACTTCACAGCGCT 3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后經(jīng)Eco81I酶切，用T4 DNA連接酶 (TaKaRa)連接至原質(zhì)粒中。

細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胚腎上皮細(xì)胞HEK293用含10%胎牛血清 (Hyclone)和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)，以30%的密度傳代于3.5 cm培養(yǎng)皿，24 h后用脂質(zhì)體法 (Lipofectam ine 2000， Invitrogen)轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為：hH1重組質(zhì)粒 (野生型或突變型)0.5μg、hβ1重組質(zhì)粒0.3μg、EGFP重組質(zhì)粒0.2μg，平行共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞。

Real-tim e PCR檢測(cè)鈉離子通道的m RNA表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染后 36 h，用 TRIzol試劑 (Invitrogen)提取細(xì)胞總 RNA，經(jīng) Nanodrop (Spectrophoto meter)定量后，以O(shè)ligo(dT)和Random hexamers為引物，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用基因特異性引物，進(jìn)行定量PCR (SYBR Green，TaKaRa)，以18S rRNA作為內(nèi)參。

Western blotting檢測(cè)鈉離子通道蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染后36～48 h，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液處理1 h后，用Nav1.5抗體 (A lomone，Israel)和內(nèi)參GAPDH抗體孵育過(guò)夜，洗脫一抗，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，進(jìn)行DAB顯色。

全細(xì)胞膜片鉗記錄鈉電流

轉(zhuǎn)染后36～48 h，選取帶有綠色熒光的轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞電流記錄。細(xì)胞外液成分 (mmol/L)：NaCl 140、KCl 5、CaCl22、MgCl21、Glucose 10、HEPES 10，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4；電極內(nèi)液成分 (mmol/L)：NaCl 35、CsF 105、MgCl21、HEPES 10、EGTA 10，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.2。電極入液后，電阻為2.2～3.3MΩ；負(fù)壓吸引至高阻抗封接 (＞1 G)后，給予快、慢電容補(bǔ)償；破膜后將串聯(lián)電阻補(bǔ)償至80%以上。將Clampex10.0數(shù)據(jù)采集軟件 (Molecular Devices，USA)的采樣頻率設(shè)置為5 kHz，濾波2 kHz[13,14]。

數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

鈉離子通道穩(wěn)態(tài)激活過(guò)程中，不同電壓下的電導(dǎo)由公式(1)(Vm為膜電位，Vrev為反轉(zhuǎn)電位)計(jì)算，并以最大電導(dǎo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

以去極化電壓為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)化電導(dǎo)為縱坐標(biāo)，用Boltzmann方程(2)擬合得到穩(wěn)態(tài)激活曲線 (V1/2為半激活電壓，k為斜率因子)。

用雙脈沖刺激檢測(cè)通道的穩(wěn)態(tài)失活過(guò)程，以預(yù)刺激脈沖的去極化電壓為橫坐標(biāo)、檢驗(yàn)脈沖下的標(biāo)準(zhǔn)化電流I/Imax為縱坐標(biāo)，用Boltzmann方程(3)擬合得到穩(wěn)態(tài)失活曲線 (V1/2為半失活電壓，k為斜率因子)[14]。

所記錄的電流用 Clampfit10.0(Molecular Devices，USA)和 Origin6.0(M icrocal Software)分析，數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，野生型與突變型電流密度的差異采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05為有顯著性差異。

結(jié)果

野生型鈉離子通道的全細(xì)胞鈉電流記錄

在熒光顯微鏡下選取帶綠色熒光的轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞鈉電流記錄。將細(xì)胞膜電位鉗制于－140mV，隨后給予電壓從－90到＋60mV、階越5mV、持續(xù)30ms的脈沖刺激，記錄不同電壓條件下的鈉電流INa。由圖2A和B可見(jiàn)，通道在－50mV左右開始激活，隨去極化程度的增加，激活電流逐漸增大，在－30mV達(dá)到峰值，而后隨著進(jìn)一步去極化又逐漸減小，所記錄的電流符合典型心肌鈉電流的特征[13,14]。

圖2 野生型與突變型鈉離子通道全細(xì)胞電流的比較 (A)野生型與突變型鈉離子通道的穩(wěn)態(tài)激活電流。細(xì)胞膜電位鉗制于－140mV，給予電壓從－90到+60mV、階越5mV、持續(xù)30ms的脈沖。(B)野生型和突變型鈉離子通道穩(wěn)態(tài)激活的I-V曲線。*P＜0.01，E375A和E375K與野生型相比。(C)野生型和突變型鈉離子通道電流密度峰值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*P＜0.01，E375A與野生型相比；**P＜0.01，E375K與E375A相比Fig.2 Who le-ce ll current com parison of wild-type(WT)and m utant sodium channe ls (A)Steady-state activation currents of WT and mutant sodium channels elicited with 30 ms depolarizing steps in 5 mV increment from －90 to +60 mV.(B)Steady-state activation I-V curves of WT and mutant sodium channels.*P＜0.01,E375A and E375K compared with WT.(C)Statistic peak current density of WT and mutant sodium channels.*P＜0.01，E375A compared with WT,**P＜0.01，E375K compared w ith E375A

E375突變對(duì)全細(xì)胞鈉電流密度的影響

如圖2A～C所示，將E375殘基突變?yōu)楸彼?(E375A)，使其側(cè)鏈負(fù)電荷被中和，突變體鈉通道的電流仍呈現(xiàn)典型心肌鈉電流的特征，但與野生型不同的是，E375A突變體的電流密度顯著減小，峰值由野生型的33.50 pA/pF減為10.72 pA/pF；將E375殘基突變?yōu)橘嚢彼?(E375K)，使其側(cè)鏈帶正電荷，全細(xì)胞鈉電流密度減小為5.28 pA/pF，與野生型和E375A相比均有顯著差異 (P＜0.05)；反之，通過(guò)天冬氨酸突變 (E375D)恢復(fù)E375側(cè)鏈的負(fù)電荷后，全細(xì)胞鈉電流又恢復(fù)至野生型水平。

E375突變對(duì)鈉離子通道穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活的影響

用Boltzmann方程分別擬合得到鈉離子通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線和穩(wěn)態(tài)失活曲線 (圖3，表1)。由穩(wěn)態(tài)激活曲線可見(jiàn)，E375A和E375K突變鈉通道的半激活電壓分別顯著左移11.33和13.83mV，斜率因子分別減小0.6和0.31；E375D半激活電壓顯著左移7.89mV，斜率因子減小0.5。

圖3 E375突變對(duì)鈉離子通道Nav1.5門控動(dòng)力學(xué)的影響 用Boltzmann方程分別擬合得到的野生型和突變型鈉離子通道穩(wěn)態(tài)激活曲線(A)和穩(wěn)態(tài)失活曲線(B)。*P＜0.05，突變型與野生型相比；**P＜0.05，E375K與E375A相比Fig.3 Effect of E375 m utation on Nav1.5 gating kinetics Steady-state activation curves(A) and steady-state inactivation curves(B)of WT and E375A,E375K,E375D mutant sodium channels,conductance from individual cells were normalized to single Boltzmann function fits.*P＜0.05,mutant compared with WT；**P＜0.05,E375K compared with E375A

表1 鈉離子通道穩(wěn)態(tài)激活與穩(wěn)態(tài)失活的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 1 Com parison of steady-state activation and steady-state inactivation of sodium channel gating kinetics

由穩(wěn)態(tài)失活曲線可見(jiàn)，E375A和E375K突變鈉通道的半失活電壓分別顯著右移6.38和9.92mV，斜率因子分別顯著增加1.14和1.16；而E375D的半失活電壓和斜率因子與野生型相比無(wú)顯著差異。

鈉離子通道及其突變體在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

分別提取總mRNA和總蛋白進(jìn)行real-time PCR和Western blotting，以檢測(cè)鈉離子通道的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，野生型與突變型鈉離子通道均可在HEK293細(xì)胞中表達(dá)，且在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)無(wú)顯著差異 (圖4)。

圖4 野生型與突變型鈉離子通道的表達(dá) (A)Real-time PCR檢測(cè)野生型和突變型鈉離子通道m(xù)RNA的表達(dá)水平；(B、C)Western blotting檢測(cè)野生型和突變型鈉離子通道蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Expression of WT and m utant sodium channel (A) Real-time PCR analysis of WT and mutant Nav1.5 mRNA expression level;(B,C) Western blotting analysis of WT and mutant Nav1.5 protein level

討論

自從鈉離子通道基因首次被成功克隆以來(lái)，研究者結(jié)合分子克隆、基因定點(diǎn)突變、基因異源表達(dá)和膜片鉗等技術(shù)，對(duì)離子通道的結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)節(jié)進(jìn)行了許多研究，為我們理解離子通道的結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)節(jié)提供了有價(jià)值的信息。P環(huán)是影響離子通道通透性和離子選擇性的關(guān)鍵部位，對(duì)位于其外口的保守性負(fù)電荷側(cè)鏈氨基酸的功能研究，為我們闡釋通道門控作用的分子機(jī)制及構(gòu)建離子通道的工作模型提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

與野生型鈉離子通道相比，E375A和E375K突變體的全細(xì)胞鈉電流密度顯著減小至10.72和5.28 pA/pF，分別為野生型的1/3和1/6，然而，real-time PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，在mRNA和蛋白水平上，E375A、E375K和E375D突變體的表達(dá)與野生型相比無(wú)顯著差異。這些結(jié)果說(shuō)明，E375A和E375K突變體電流密度的減小并非由通道表達(dá)量而是由通道電導(dǎo)的改變引起的。

Chiamvimonvat[12]和Zhang[13]等發(fā)現(xiàn)，大鼠骨骼肌鈉通道Nav1.4的E403C突變會(huì)引起通道電導(dǎo)的顯著減小，使用巰基修飾劑MTSES使半胱氨酸側(cè)鏈恢復(fù)負(fù)電荷后，單通道和全細(xì)胞鈉電流均恢復(fù)至野生型水平，提示E403側(cè)鏈的負(fù)電荷是決定Nav1.4電導(dǎo)的關(guān)鍵因素。

本研究中，我們將人心肌鈉離子通道Nav1.5的同源性位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?(E375A)，使其側(cè)鏈負(fù)電荷被中和，全細(xì)胞鈉電流密度顯著減小至10.72 pA/pF，為野生型的1/3。通過(guò)E375K突變，將E375置換為正電性的賴氨酸，全細(xì)胞鈉電流密度顯著減小為5.28 pA/pF，為野生型的1/6、E375A的1/2。而在E375D突變體中，側(cè)鏈負(fù)電荷恢復(fù)，全細(xì)胞鈉電流密度也相應(yīng)地恢復(fù)至28.40 pA/pF，與野生型相比無(wú)顯著差異。這一結(jié)果也說(shuō)明，在電壓門控型鈉離子通道結(jié)構(gòu)域I中，P環(huán)外口保守性谷氨酸側(cè)鏈的負(fù)電荷對(duì)通道電導(dǎo)的決定作用具有普遍性。

與野生型鈉離子通道相比，E375A與E375K突變體的半激活電壓均顯著左移，斜率因子略有減小，而E375D突變并不能充分消除這種左移現(xiàn)象，這與Nav1.4的E403C突變不影響通道的激活過(guò)程不同。推測(cè)導(dǎo)致這種差異的原因，可能是由于Nav1.5和Nav1.4在谷氨酸臨近位點(diǎn)的氨基酸殘基存在電荷差異，前者為正電性的R376，而后者為電中性的N404。

與穩(wěn)態(tài)激活過(guò)程不同，在穩(wěn)態(tài)失活過(guò)程中，E375A突變體的半失活電壓顯著右移6.38mV，斜率因子顯著增加1.14；E375K的半失活電壓顯著右移9.92mV，與野生型和E375A相比均有顯著差異 (P＜0.05)，斜率因子顯著增加1.16。通過(guò)E375D突變恢復(fù)375殘基側(cè)鏈的負(fù)電荷后，通道的穩(wěn)態(tài)失活過(guò)程相應(yīng)地恢復(fù)至野生型水平，半失活電壓和斜率因子與野生型無(wú)顯著差異。說(shuō)明E375殘基側(cè)鏈的負(fù)電荷決定鈉離子通道Nav1.5的穩(wěn)態(tài)失活過(guò)程。

Na+、K+、Ca2+等電壓門控型陽(yáng)離子通道的結(jié)構(gòu)域共享包含6個(gè)跨膜肽段的結(jié)構(gòu)，電壓感受器S4均富含正電性的側(cè)鏈賴氨酸和精氨酸，提示靜電相互作用在離子通道的電壓依賴性開放與關(guān)閉過(guò)程中起著根本性的作用。在鈉離子通道的激活過(guò)程中，隨著膜電位的去極化，S4從膜內(nèi)伸出，由此誘發(fā)通道構(gòu)象的改變而使“激活閘門”開放。失活分為兩個(gè)步驟：跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ位于胞內(nèi)的連接部分移向內(nèi)口并堵塞通道導(dǎo)致的快速失活 (fast inactivation)，以及通道內(nèi)部構(gòu)象變化引起的緩慢失活 (slow inactivation)[4,15～17]。我們推測(cè)，在鈉離子通道的門控過(guò)程中，P環(huán) (結(jié)構(gòu)域I)外口的保守性負(fù)電荷谷氨酸側(cè)鏈，可能通過(guò)與S4片段的正電性殘基之間的靜電相互作用來(lái)決定通道的緩慢失活過(guò)程。本研究中，E375不同突變體的側(cè)鏈大小 (長(zhǎng)短)、極性、疏水性等也有可能對(duì)通道內(nèi)部的微結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致通道功能的偏移，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

致謝 美國(guó)哥倫比亞大學(xué)藥理學(xué)系Robert S.Kass教授友好提供pcDNA3.1-SCN5A和pcDNA3.1-SCN5B重組質(zhì)粒，在此表示感謝。

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