倪志華, 陳景春, 張玉明, 葛大勇,趙曉輝, 王淑芳

1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071002；2.河北大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，保定 071002

引言

蛋白質(zhì)的折疊與去折疊是結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向[1]。采用物理或化學(xué)的方法改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使用光譜學(xué)和生物學(xué)方法研究蛋白質(zhì)的去折疊過(guò)程，是目前結(jié)構(gòu)生物學(xué)廣泛采用的技術(shù)路線(xiàn)之一[2～6]。隨著激光生物學(xué)的發(fā)展，激光在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用得到了廣泛關(guān)注。Zhang等[7]成功使用激光偏振光技術(shù)檢測(cè)了生物芯片的抗體蛋白，令激光替代傳統(tǒng)熒光標(biāo)記技術(shù)無(wú)損檢測(cè)生物芯片顯示出誘人的應(yīng)用前景，同時(shí)，也使激光輻照與蛋白質(zhì)作用關(guān)系的研究顯得尤為迫切。Yasuyuki[8]和Oujja[9]分別報(bào)道了激光輻照對(duì)蠶絲蛋白和膠原蛋白的影響，結(jié)果顯示，高強(qiáng)度激光輻照會(huì)顯著改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)；Soustov[10]使用308 nm XeCl準(zhǔn)分子激光輻照眼晶狀體蛋白，發(fā)現(xiàn)激光引發(fā)了蛋白質(zhì)的光聚合現(xiàn)象；Yoshikawa等[11]使用飛秒激光器考察激光與葡萄糖異構(gòu)酶的相互作用，探討了不同波長(zhǎng)和能量的激光對(duì)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。目前的文獻(xiàn)多側(cè)重于報(bào)道激光輻照引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，然而，蛋白質(zhì)多具有生物活性，綜合考察激光輻照引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、生物活性及分子水平構(gòu)效關(guān)系的變化，具有更為重要的理論意義，并且可為生物芯片檢測(cè)裝備的研制提供必要的技術(shù)支持。

溶菌酶 (lysozyme，EC3.2.1.7)是一種單體球蛋白，由129個(gè)氨基酸組成，含有4對(duì)二硫鍵，6個(gè)色氨酸 (Trp)，分子中不含有其它非氨基酸的組分，在生化領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。溶菌酶的分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單明確，且分子內(nèi)的色氨酸可作為內(nèi)源熒光探針[12]，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的良好模型。本文中，我們利用308 nm的XeCl準(zhǔn)分子激光器處理溶菌酶，借助熒光光譜和核磁共振技術(shù)分析了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，并結(jié)合電泳技術(shù)及生物活性測(cè)定等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，考察了激光輻照對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的影響。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料及儀器

溶菌酶為 Sigma公司進(jìn)口分裝，溶菌酶活性測(cè)定試劑盒為南京建成科技有限公司產(chǎn)品，D2O為美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories，Inc.產(chǎn)品，其它試劑均為分析純。

溶菌酶溶液用20mmol/L NaAc-HAc緩沖液 (pH5.2)配制。

XeCl準(zhǔn)分子激光器為美國(guó)Coherent公司產(chǎn)品，型號(hào)為Compex Pro205，輸出波長(zhǎng)308 nm，脈寬為20 ns；穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀為英國(guó)Edinburgh Instruments公司產(chǎn)品，型號(hào)為FLS 920；蛋白電泳儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品，型號(hào)為BIO-RAD Model 250/2.5；核磁共振光譜儀為瑞士Bruker公司產(chǎn)品，型號(hào)為Bruker AVANCEⅢ 600MHz。

激光輻照溶菌酶溶液

溶菌酶溶液的濃度為2.5 g/L。使用XeCl準(zhǔn)分子激光器 (激光波長(zhǎng)308 nm，能量密度0.3m J/mm2，頻率5 Hz，光斑面積1 cm×4 cm)輻照處理，脈沖數(shù)分別為25、50、100、200、600、1200、1800、3600和7200，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持25℃的恒溫。輻照處理后，立即進(jìn)行分析檢測(cè)，取未經(jīng)輻照處理的樣品為對(duì)照。

熒光光譜分析

激發(fā)波長(zhǎng)定為295 nm， (25±1)℃下掃描3次，掃描波長(zhǎng)范圍為300～450 nm。熒光光譜激發(fā)光譜分辨率為3 nm，發(fā)射光譜分辨率為1 nm。

溶菌酶生物活性測(cè)定

依檢測(cè)試劑盒中的空白對(duì)照法測(cè)定溶菌酶輻照處理后的生物活性，與未經(jīng)輻照處理的對(duì)照樣品進(jìn)行比較分析。

SDS-PAGE分析

為研究激光輻照后溶菌酶的存在形式和分子間的作用機(jī)制，參考邊六交等人[13]的方法，以還原和非還原SDS-PAGE法檢測(cè)溶菌酶結(jié)構(gòu)的變化。SDS-PAGE分析使用常規(guī)的蛋白質(zhì)電泳方法[14]。

核磁共振1H譜分析

以含5%D2O的20mmol/L NaAc-HAc緩沖液配置1mmol/L的溶菌酶溶液，分別輻照處理1800、3600和7200個(gè)脈沖后，分析溶菌酶1H譜的變化。操作參考Bachmann等[15]的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

圖1 溶菌酶溶液在280～350 nm波長(zhǎng)的吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of lysozym e so lution at the wavelength of 280～350 nm

圖2 XeCl輻照后溶菌酶體系的熒光光譜 從上到下依次是溶菌酶溶液經(jīng)XeCl激光輻照25、50、100、200、0(對(duì)照)、600、1200、1800、3600和7200個(gè)脈沖后，蛋白激發(fā)光譜的變化情況 (激發(fā)光波長(zhǎng)為295 nm)Fig.2 lntrinsic relative fluorescence intensity(RFI)of lysozym e after laser irradiation From top to bottom:changes of protein excitation spectrum of lysozyme solution after XeCl laser irradiation of 25,50, 100,200,0(control),600,1200,1800,3600 and 7200 pulse(excitation light wavelength is 295 nm)

結(jié)果與討論

XeCl輻照后溶菌酶內(nèi)源熒光光譜的變化

圖1為2.5 g/L溶菌酶溶液的吸收光譜。由于溶菌酶分子內(nèi)含有色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，其最大吸收波長(zhǎng)為295 nm，且在308 nm處有較強(qiáng)吸收，其摩爾吸收系數(shù)ε分別為5645和3240。

圖2顯示了激光輻照后溶菌酶熒光光譜的變化。由圖可見(jiàn)，其333 nm處的內(nèi)源熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了有規(guī)律的變化，與未經(jīng)輻照處理的對(duì)照樣品相比，在25個(gè)脈沖的激光輻照后，溶菌酶的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有所加強(qiáng)，之后，隨著輻照脈沖數(shù)的增大，內(nèi)源熒光強(qiáng)度又逐漸減弱，但在200個(gè)脈沖以?xún)?nèi)，熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組。在高于200個(gè)脈沖的激光處理后，溶菌酶的內(nèi)源熒光強(qiáng)度進(jìn)一步減弱，并且出現(xiàn)了紅移 (36 nm)，這在圖3中也可以看到。

內(nèi)源熒光探針色氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)為334 nm左右，熒光強(qiáng)度的大小與色氨酸微環(huán)境的疏水性相關(guān)[16]。當(dāng)溶菌酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊變性，即肽鏈由緊密有序的球狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)為松散的長(zhǎng)鏈狀態(tài)，色氨酸所處微環(huán)境的疏水性降低，熒光強(qiáng)度也隨之降低。經(jīng)200個(gè)及以上脈沖的激光處理后，熒光強(qiáng)度的變化及最大發(fā)射波長(zhǎng)的紅移現(xiàn)象，也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

200個(gè)脈沖的激光輻照前，333 nm處的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了增高現(xiàn)象，這可能是由于低劑量的激光處理使溶菌酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生“微調(diào)”，色氨酸遠(yuǎn)離了周?chē)臒晒獯銣缁鶊F(tuán)，從而使熒光強(qiáng)度暫時(shí)增加。這與潘婷婷等[17]對(duì)溶菌酶的研究結(jié)果一致，說(shuō)明激光輻射對(duì)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化具有階段性作用。

激光輻照對(duì)溶菌酶活力的影響

如圖3所示，隨著輻照脈沖數(shù)的增加，溶菌酶的活力出現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)。低于200個(gè)脈沖的激光輻照，對(duì)溶菌酶的生物活性具有激活作用。隨著輻照脈沖數(shù)的繼續(xù)增加，溶菌酶的活力迅速降低。說(shuō)明高強(qiáng)度的激光破壞了溶菌酶分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其生物活性的逐步喪失。

溶菌酶的生物活性以200個(gè)脈沖輻照為臨界點(diǎn)變化的趨勢(shì)，與熒光光譜分析的結(jié)果相互印證。說(shuō)明低劑量熒光輻照引起的分子結(jié)構(gòu)的“微調(diào)”，有助于增強(qiáng)溶菌酶的生物活性，這與楊芳等[18]鹽酸胍處理溶菌酶的試驗(yàn)結(jié)果一致。而且，此結(jié)果還間接支持了被廣泛認(rèn)可的低能量激光輻照具有臨床醫(yī)療價(jià)值的理論[19]。

圖3 溶菌酶體系在XeCl輻照后熒光光譜的紅移及酶活變化情況Fig.3 Red shift and relative activity of lysozym e after XeCl laser irradiation

SDS-PAGE檢測(cè)溶菌酶去折疊過(guò)程中的蛋白存在形式

取激光輻照后的溶菌酶樣品，分別與還原樣品液和非還原樣品液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示，隨著輻照脈沖數(shù)的增加，溶菌酶分子出現(xiàn)了聚合現(xiàn)象。溶菌酶在被50個(gè)脈沖的激光輻照后出現(xiàn)二聚體，200個(gè)脈沖輻照后出現(xiàn)二聚體和三聚體，600個(gè)脈沖輻照后，又逐漸出現(xiàn)了四聚體，如圖4、圖5所示；經(jīng)巰基乙醇還原后，溶菌酶在100個(gè)脈沖的激光輻射后才出現(xiàn)二聚體，1800個(gè)脈沖輻照后出現(xiàn)三聚體，3600個(gè)脈沖輻照后出現(xiàn)四聚體。在兩種情況下，二聚體的數(shù)量都隨著輻照脈沖數(shù)的增加而增加。

由此可知，一部分聚合是由于溶菌酶形成了分子間的二硫鍵，也有一部分二聚體是由于溶菌酶形成了淀粉樣沉淀，這些聚合體在加入巰基乙醇還原劑后不能打開(kāi)，說(shuō)明可能有其他的結(jié)合方式參與了聚合體的形成，比如強(qiáng)的非共價(jià)相互作用等。邊六交等[13]在研究變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過(guò)程時(shí)，也有過(guò)類(lèi)似的報(bào)道。

激光輻照后溶菌酶的1H譜變化

1H-NMR譜的結(jié)果表明，溶菌酶的Trp111、Trp63和Trp62經(jīng)激光輻照后的化學(xué)位移發(fā)生了變化 (圖5)，且隨著輻照脈沖數(shù)的增加而加大。因溶菌酶在308 nm處有較強(qiáng)的吸收，對(duì)此波長(zhǎng)的激光敏感，高級(jí)結(jié)構(gòu)易于被破壞。因此，推測(cè)激光輻照后溶菌酶的空間結(jié)構(gòu)受到了影響。

圖4 溶菌酶經(jīng)XeCl激光輻照后的SDS-PAGE (A)SDS-非還原電泳結(jié)果；(B)SDS-還原電泳結(jié)果。M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～10：依次是溶菌酶溶液經(jīng)XeCl激光輻照0(對(duì)照)、25、50、100、200、600、1200、1800、3600和7200個(gè)脈沖后的結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE of lysozym e a fter XeCl laser irradiation (A)Non-reducing SDS-PAGE; (B)Reducing SDS-PAGE.M:Protein marker;1～10:Results of lysozyme solution after XeCl laser irradiation of 0(control),25,50,100,200,600,1200,1800,3600 and 7200 pulse

圖5 激光輻照后溶菌酶結(jié)構(gòu)變化的1H-NMR譜 從上到下的輻照脈沖數(shù)分別是0、1800、3600和7200Fig.5 1H-NMR study of lysozym e a fter laser irradiation Numbers of laser irradiation pulse (from top to bottom)are 0,1800,3600 and 7200

結(jié)論

溶菌酶經(jīng)308 nm XeCl準(zhǔn)分子激光輻照后，其熒光光譜、活性和電泳行為都發(fā)生了改變。低脈沖數(shù)的激光輻照對(duì)溶菌酶有一定的激活作用，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度增高和活性增強(qiáng)，但是，隨著輻照脈沖數(shù)的繼續(xù)增加，溶菌酶分子發(fā)生了聚合，熒光強(qiáng)度降低，活性喪失，色氨酸1H的化學(xué)位移也發(fā)生了變化，說(shuō)明高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化使得溶菌酶的功能逐漸喪失。

本實(shí)驗(yàn)就激光輻照對(duì)酶的影響機(jī)制作了初步探索，為激光輻照誘導(dǎo)蛋白質(zhì)去折疊機(jī)制的研究提供了實(shí)驗(yàn)參考。

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