劉俊宏，邵偉波，李 莉，楊 穎

（1.華東政法大學(xué)，上海200042；2.蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州215123；3.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063；4.上海市血液中心，上海200051）

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）通常是由長(zhǎng)度為2～5個(gè)堿基的核心序列串聯(lián)重復(fù)而成，具有分布廣泛、多態(tài)性高及易于擴(kuò)增等特性[1]，STR分型已成為法醫(yī)物證檢驗(yàn)的主要技術(shù)手段。目前我國(guó)廣泛使用的試劑盒主要為Identifiler○R，SinofilerTM和Powerplex○R16 System，基本上可以滿足個(gè)體識(shí)別和親子鑒定的需要，但在突變和特殊案件中，需要檢測(cè)更多的STR基因座來(lái)補(bǔ)充當(dāng)前STR系統(tǒng)的不足。本研究選擇了非CODIS系統(tǒng)的6個(gè)基因座，即D4S2366、

D3S3045、D18S1002、D20S481、D22S689、D4S2639，建立了熒光復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系，并將該體系應(yīng)用于224名華東漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的基因型檢測(cè)，評(píng)估了其作為新的遺傳標(biāo)記在華東漢族人群中的法醫(yī)學(xué)價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本

224份血斑（每份約3mm×3mm大?。?，分別來(lái)源于華東地區(qū)漢族無(wú)關(guān)個(gè)體，Chelex-100法[2]提取血液DNA。

1.2 引物

6個(gè)基因座的熒光引物序列來(lái)自GDB基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，其具體信息和熒光素標(biāo)記見(jiàn)表1。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.3 PCR復(fù)合擴(kuò)增體系及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR復(fù)合擴(kuò)增體系為20μL，內(nèi)含10×PCR buffer 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，25 mmol/L Mg2+2 μL，primer pair mix 2μL，AmpliTaq GoldR○DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板量5μL，純水6.5μL。采用9700型擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司）進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為：95℃15min；94℃30s，56℃90s，72℃60s，循環(huán)30次；60℃60min；4℃保存。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1μL、去離子甲酰胺（美國(guó)AB公司）10μL、內(nèi)標(biāo)SIZ-350（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）0.3μL混合，95℃變性3min，冰浴3min，使用3130遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）電泳檢測(cè)。

1.4 等位基因測(cè)序、命名

根據(jù)在GALAXY網(wǎng)站上查到的DNA序列，采用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)用于克隆測(cè)序的PCR引物，其具體信息見(jiàn)表2。設(shè)計(jì)好的引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。選取每個(gè)基因座各個(gè)等位基因的樣本，用所合成的測(cè)序引物分別對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)各等位基因的測(cè)序結(jié)果，確定核心序列重復(fù)次數(shù)，按照國(guó)際法醫(yī)血液遺傳學(xué)會(huì)DNA委員會(huì)ISFH推薦的命名原則進(jìn)行命名[3~4]。

表1 復(fù)合擴(kuò)增體系中6個(gè)基因座的引物特征

表2 6個(gè)基因座的測(cè)序引物特征

1.5 等位基因梯度標(biāo)準(zhǔn)（Allelic Ladder）的制備

選取各基因座含不同等位基因的樣本，用熒光標(biāo)記引物單獨(dú)擴(kuò)增后，通過(guò)多次調(diào)節(jié)模板量濃度、擴(kuò)增次數(shù)及混合比例，制備Allelic Ladder。

1.6 靈敏度檢測(cè)

將標(biāo)準(zhǔn)品DNA 9947A（10ng/μL）稀釋成如下濃度梯度：2 ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0625 ng/μL、0.03125 ng/μL、0.015625 ng/μL，用復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在3130遺傳分析儀上電泳檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用PowerStats V12.xls[5]軟件統(tǒng)計(jì)分析D4S2366等6個(gè)非CODIS STR基因座的等位基因頻率、雜合度（H）、個(gè)體識(shí)別能力（DP）和多態(tài)信息含量（PIC）等參數(shù)，采用Cervus2.0軟件統(tǒng)計(jì)分析二聯(lián)體非父排除率（PED）和三聯(lián)體非父排除率（PET），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.8 排除效能統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用所建立的復(fù)合擴(kuò)增體系，對(duì)93個(gè)經(jīng)Sinofiler試劑盒（美國(guó)AB公司）檢測(cè)已排除非父的二聯(lián)體案例進(jìn)行分析，討論其在實(shí)際案例中的運(yùn)用價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 6個(gè)STR基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系

本文構(gòu)建的6個(gè)非CODIS STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系分型穩(wěn)定，具有種屬特異性，且適用于各類生物學(xué)檢材。標(biāo)準(zhǔn)品DNA 9947A的分型結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 6個(gè)STR基因座各等位基因測(cè)序結(jié)果

通過(guò)測(cè)序得到6個(gè)STR基因座每個(gè)等位基因的核心重復(fù)序列（見(jiàn)表3），按國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)推薦原則，以核心序列重復(fù)次數(shù)命名等位基因。

2.3 Ladder制備結(jié)果

將6個(gè)STR基因座的各個(gè)等位基因用熒光標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增，依照熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)各個(gè)PCR產(chǎn)物的比例，制成Ladder見(jiàn)圖2。

2.4 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

將標(biāo)準(zhǔn)品DNA 9947A（10ng/μL）稀釋成如下濃度梯度：2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0625ng/μL、0.03125ng/μL、0.015625ng/μL，用復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在3130遺傳分析儀上電泳分離，使用Genemapper軟件分析結(jié)果。在四種熒光素中，ROX產(chǎn)生的峰高普遍低于其它熒光素，通過(guò)觀察用ROX標(biāo)記的基因座的峰高，發(fā)現(xiàn)20 μL體系中模板DNA濃度為0.125ng/μL時(shí)效果最好，但濃度低至0.03125ng/μL時(shí)仍能得到正確的分型結(jié)果，提示該體系的靈敏度為156.25pg。

表3 6個(gè)STR基因座各等位基因的序列特征

2.5 6個(gè)基因座的等位基因頻率分布

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品DNA9947A分型圖

在華東地區(qū)漢族 224名無(wú)關(guān)個(gè)體中，6個(gè)非CODIS STR基因座共檢出52個(gè)等位基因，各等位基因頻率見(jiàn)表4。

圖2 6個(gè)STR基因座的Allelic Ladder

2.6 法醫(yī)學(xué)參數(shù)

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，D4S2366等6個(gè)STR基因座的雜合度（H）分布為 0.714～0.808，個(gè)體識(shí)別率（DP）為0.874～0.934，二聯(lián)體非父排除率（PED）為0.310～0.453，三聯(lián)體非父排除率（PET）為0.485～0.628，多態(tài)信息含量（PIC）為0.672～0.784，基因型頻率分布通過(guò)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（P＞0.05），見(jiàn)表5。6個(gè)STR基因座的二聯(lián)體累積非父排除率（CPED）為0.947689，三聯(lián)體累積非父排除率（CPET）為0.993345，累積個(gè)人識(shí)別能力（CDP）為0.999999543。

2.7 實(shí)際案例應(yīng)用

將復(fù)合擴(kuò)增體系應(yīng)用于93例二聯(lián)體排除案例，每個(gè)基因座的排除概率（見(jiàn)表6）與其二聯(lián)體非父排除率（PED）指標(biāo)（見(jiàn)表5）基本一致。

表4 6個(gè)STR基因座在華東漢族人群的等位基因頻率分布 （n=224）

表5 華東漢族人群6個(gè)STR基因座的相關(guān)法醫(yī)學(xué)參數(shù)（n=224）

3 討論

構(gòu)建熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系的主要步驟包括基因座的選擇、引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件的優(yōu)化。引物的設(shè)計(jì)選擇要有高度特異性，不同引物之間不能互相干擾，應(yīng)避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，同時(shí)還需要考慮片段大小等因素。本研究采用的是多重PCR擴(kuò)增體系，作者通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)調(diào)整各個(gè)基因座的引物量，最終得到了比較理想的配比方案。同時(shí)，對(duì)退火溫度及循環(huán)次數(shù)也進(jìn)行了梯度試驗(yàn)，建立了合適的PCR擴(kuò)增方法。復(fù)合PCR體系中，模板濃度的最低量為0.03125ng/μL，各個(gè)STR基因座的擴(kuò)增片段大小均小于350bp，因此適用于降解檢材的DNA分型。

本文選擇的是6個(gè)非CODIS STR基因座，通過(guò)對(duì)華東漢族224個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體的檢測(cè)，在D4S2366、D3S3045、D18S1002、D20S481、D22S689、D4S2639STR基因座分別檢出 7、8、9、10、9、9個(gè)等位基因和 21、26、21、23、28、32種基因型，各基因座的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。6個(gè)基因座中，D4S2639非父排除率最高，D20S481非父排除率最低，各基因座平均雜合度（H）為 0.760，平均個(gè)體識(shí)別率（DP）為0.910，平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.735，二聯(lián)體累積非父排除率（CPED）為0.947689，三聯(lián)體累積非父排除率（CPET）為 0.993345，累積個(gè)人識(shí)別能力（CDP）為0.999999543，表明上述6個(gè)STR基因座在中國(guó)漢族人群中具有高度的多態(tài)性，其復(fù)合擴(kuò)增體系的效能適用于法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別。另外，作為常規(guī)STR標(biāo)記的補(bǔ)充，上述6個(gè)基因座可用于存在突變情形的二聯(lián)體、三聯(lián)體鑒定，也可用于因累積親權(quán)指數(shù)低于標(biāo)準(zhǔn)值[6]而不能明確鑒定意見(jiàn)的親權(quán)鑒定案件。

表6 6個(gè)基因座在實(shí)際案例中的排除率 （n=93）

[1]Schuler GD，Boguski MS，Stewart EA，et al.A gene map of the human genome[J].Science，1996，274（5287）：540-546.

[2]Walsh P S，Metzger D A，Higuchi R.Chelex-100 as a medium for simple xtraction of DNA for PCR-based typing from forensic materia[J].Biotechniques，1991，10：506-513.

[3]Lincoln P J.DNA recommendations-further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems.Forensic Sci Int.1997 Jun 23，87（3）：181-184.

[4]B?r W，Brinkmann B，Budowle B，et al.DNA recommendations.Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems.International Society for Forensic Haemogenetics[J].Int J Legal Med，1997，110（4）：175-176.

[5]Promega Biotech Co.，Ltd.Powerstates V12.xls.[EB/OL] http：//www.promega.com/geneticidtools/.

[6]司法部司法鑒定技術(shù)規(guī)范[S].SF/Z JD0105001-2010.