顏肇?fù)P

(福建省德化縣中醫(yī)院，福建 德化 362500)

86株流感嗜血桿菌分離鑒定及耐藥性分析

顏肇?fù)P

(福建省德化縣中醫(yī)院，福建 德化 362500)

目的探討適合臨床實(shí)際的流感嗜血桿菌分離鑒定方法，并了解本地區(qū)社區(qū)獲得性下呼吸道感染患者分離的流感嗜血桿菌耐藥性。方法常規(guī)培養(yǎng)并結(jié)合標(biāo)本直接涂片革蘭染色鏡檢挑選可疑菌落，衛(wèi)星試驗(yàn)和V+X、V、X因子需求試驗(yàn)進(jìn)行初步鑒定，法國生物梅里埃公司API NH鑒定板條進(jìn)行復(fù)核鑒定；K-B法藥敏，結(jié)果判斷依據(jù)CLSI2010版標(biāo)準(zhǔn)；Nitrocefin法測(cè)定β內(nèi)酰胺酶。結(jié)果86份流感嗜血桿菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接涂片鏡檢均為合格標(biāo)本，并可見大量WBC吞噬和/或伴行革蘭陰性小桿菌(形似流感嗜血桿菌)。86株流感嗜血桿菌中產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶17株，產(chǎn)酶率19.8%；對(duì)測(cè)試的8種藥物中，復(fù)方新諾明敏感性最低(38.4%)，其次為氨芐西林(73.3%)、阿奇霉素(83.7%)和頭孢呋辛(84.9%)，對(duì)亞胺培南、阿莫西林/克拉維酸、左旋氧氟沙星和頭孢噻肟敏感性較好，均在95%以上。結(jié)論實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)重視標(biāo)本直接涂片鏡檢，并結(jié)合培養(yǎng)提高HIN分離率。HIN對(duì)常用抗生素的耐藥率應(yīng)引起臨床醫(yī)師重視，注意合理使用抗菌藥物。

流感嗜血桿菌；直接涂片；革蘭染色；耐藥性；β-內(nèi)酰胺酶

流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae，HIN)為人類社區(qū)獲得性呼吸道感染的常見致病菌，主要引起人類中耳炎、肺炎、咽炎、及其他呼吸道感染等疾病[1]。隨著抗生素濫用日趨嚴(yán)重，流感嗜血桿菌的耐藥性受到普遍關(guān)注。本文對(duì)本院2007年1月至2011年1月間分離自社區(qū)獲得性呼吸道感染患者的流感嗜血桿菌及體外藥物敏感試驗(yàn)資料進(jìn)行回顧性分析,以期為臨床合理用藥提供依據(jù)。結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來自我院2007年1月至2011年1月呼吸內(nèi)科住院48h內(nèi)患者及門診患者合格呼吸道標(biāo)本788份,包括自然咳痰、導(dǎo)管吸痰、支氣管纖維鏡保護(hù)性毛刷刷取物、支氣管肺泡灌洗液等。

1.2 試劑 血平板、巧克力平板(含5mg/100ml萬古霉素)為本實(shí)驗(yàn)室自行配置，培養(yǎng)基半成品購自英國Oxoid公司、HTM藥敏專用培養(yǎng)基購自美國BD公司，API NH鑒定板條購自法國生物梅里埃公司，藥敏紙片、V+X、V、X因子均購自英國Oxoid公司。

1.3 菌株分離與鑒定

1.3.1 標(biāo)本接種培養(yǎng) 送檢標(biāo)本立即直接涂片濕片觀察細(xì)胞種類和數(shù)量，依據(jù)全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第3版判斷標(biāo)準(zhǔn)，若合格可接受則接種血平板和巧克力平板，置于35℃，5%CO2培養(yǎng)24h。

1.3.3 標(biāo)本直接涂片染色鏡檢 參考文獻(xiàn)對(duì)所有標(biāo)本均進(jìn)行直接涂片革蘭染色鏡檢[2]。取標(biāo)本膿性部分少許，接種環(huán)直接涂抹玻片，自然干燥、火焰固定，鏡檢。油鏡下若見大量形態(tài)單一、革蘭陰性小桿菌(點(diǎn)狀、小桿狀)，且與WBC伴行和/或能見吞噬現(xiàn)象(圖1)，則可疑為流感嗜血桿菌。

圖1 大量WBC，伴行和/或吞噬G陰性小桿菌(箭頭所示)，形似流感嗜血桿菌

1.3.2 可疑菌落挑選 挑取血平板上不生長(zhǎng)、巧克力平板上生長(zhǎng)的透明或半透明、扁平、濕潤的露滴狀菌落。革蘭染色形態(tài)及大小與標(biāo)本直接涂片可疑菌體類似即為可疑菌落。

1.3.3 衛(wèi)星試驗(yàn)及V、X、X+V因子需求試驗(yàn)，操作按全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第3版要求進(jìn)行。

1.3.4 根據(jù)直接涂片染色鏡檢、菌落形態(tài)、衛(wèi)星試驗(yàn)及因子需求試驗(yàn)等特點(diǎn)進(jìn)行菌株鑒定。

1.3.5 菌株復(fù)核鑒定 采用法國生物梅里埃公司API NH鑒定板條進(jìn)行，操作按說明進(jìn)行。

1.4 β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定 采用頭孢硝噻吩法，操作按照說明書進(jìn)行。

1.5 體外藥敏試驗(yàn) 采用K-B法分別進(jìn)行阿奇霉素(AZI)、氨芐西林(AMP)、復(fù)方新諾明(SXT)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢噻肟(CTX)、亞胺培南(IPM)、左旋氧氟沙星(LEV)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)8種藥物的敏感性測(cè)定，按CLSI2010版的標(biāo)準(zhǔn)來判定試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 室內(nèi)質(zhì)量控制 選取ATCC49247為質(zhì)控菌株對(duì)上述實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行全程質(zhì)控。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用WHONET 5.4版專用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 788份標(biāo)本中，86份標(biāo)本HIN培養(yǎng)陽性，陽性率10.9%；包括自然咳痰69份，導(dǎo)管吸痰8份，支氣管纖維鏡保護(hù)性毛刷刷取物5份，支氣管肺泡灌洗液4份。

2.2 86例HIN感染患者一般臨床資料 86例患者，其中男性59例，女性27例，年齡14～89歲。48例(55.8%)有基礎(chǔ)病包括慢性阻塞性肺病、支氣管擴(kuò)張癥等，38例(44.2%)為單純社區(qū)獲得性肺炎。

2.3 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè) 86株流感嗜血桿菌中檢出17株β-內(nèi)酰胺酶陽性，產(chǎn)酶率為19.8%。

2.4 流感嗜血桿菌對(duì)8種抗生素體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 86株流感嗜血桿菌耐藥性分布

3 討論

HIN是社區(qū)獲得性呼吸道細(xì)菌性感染的重要病原菌之一。有研究表明，HIN可以通過纖毛與非纖毛黏附素黏附和侵入到呼吸道上皮細(xì)胞，又通過外膜蛋白的改變逃脫中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬,從而在呼吸道長(zhǎng)期定植[3]。當(dāng)患者免疫力下降，尤其是合并有基礎(chǔ)病如慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管擴(kuò)張癥等時(shí)，HIN可侵犯下呼吸道，導(dǎo)致感染的發(fā)生。本組資料中，超過50%的患者合并有上述基礎(chǔ)病。

HIN對(duì)營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)條件苛刻。能否分離到HIN及分離率的高低成為衡量實(shí)驗(yàn)室水平的重要標(biāo)志[4]。對(duì)下呼吸道感染者，HIN在國內(nèi)尤其是綜合性醫(yī)院分離率不高，臨床分離株多來自上呼吸道輕癥感染者咽拭子標(biāo)本。迄今為止，對(duì)HIN分離培養(yǎng)條件的探索研究日臻成熟，但實(shí)際上單純依賴培養(yǎng)并不能避免漏檢和假陽性出現(xiàn)。一方面，由于抗菌藥物濫用嚴(yán)重，相當(dāng)比例的患者在培養(yǎng)前接受過不同種類、療程不等的抗菌藥物經(jīng)驗(yàn)性治療 (自行或醫(yī)囑)。而經(jīng)驗(yàn)性治療的直接后果是導(dǎo)致HIN部分或完全殺滅/抑制，從而漏檢，分離率下降；另一方面，實(shí)驗(yàn)室人員感性認(rèn)識(shí)積累不夠，尤其是對(duì)受抗菌藥物抑制而未呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的情況容易忽略而漏檢；第三，隨著HIN高選擇性培養(yǎng)基的大量使用，使一些上呼吸道標(biāo)本中定植的HIN很容易被分離而導(dǎo)致假陽性。本組資料對(duì)高危人群合格呼吸道標(biāo)本HIN分離率達(dá)10.9%，86份呼吸道標(biāo)本在接種培養(yǎng)同時(shí)均進(jìn)行直接涂片革蘭染色，鏡檢結(jié)果表明，所有標(biāo)本均為合格可接受(WBC＞25個(gè)，SEC＜10個(gè)/LP)，均可見大量WBC伴行大量染色、形態(tài)單一，細(xì)小桿菌或球桿菌，并可見明顯吞噬現(xiàn)象(圖1)。結(jié)合社區(qū)獲得性下呼吸道感染病原體流行病學(xué)資料，不難推斷，涂片所見流感嗜血桿菌概率極大。依據(jù)涂片結(jié)果指引，仔細(xì)觀察生長(zhǎng)情況，有的放矢，可最大限度避免漏檢。

長(zhǎng)期以來,氨芐西林和阿莫西林是治療HIN感染的最常用首選藥物，上世紀(jì)七十年代HIN對(duì)氨芐西林耐藥首次在歐洲被報(bào)道，隨后全世界均有這方面的報(bào)道。近年來，國內(nèi)報(bào)道該菌對(duì)氨芐西林的耐藥率也在逐年增加,且不同地區(qū)間存在差別[5，6]。本文的結(jié)果表明，HIN對(duì)復(fù)方新諾明敏感性最低(38.4%)，提示該藥不宜作為經(jīng)驗(yàn)治療選用。其次，HIN對(duì)氨芐西林(73.3%)、阿奇霉素(83.7%)和頭孢呋辛(84.9%)，而對(duì)亞胺培南、阿莫西林/克拉維酸、左旋氧氟沙星和頭孢噻肟敏感性較好，均在95%以上，經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用上述藥物治療HIN感染應(yīng)具有確切的療效。HIN對(duì)氨芐西林的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,目前研究認(rèn)為流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶以質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM-1型酶為主，小部分產(chǎn)ROB-1型酶[7]。HINβ-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)陽性可預(yù)測(cè)該菌對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林耐藥，氨芐西林的藥敏結(jié)果可預(yù)測(cè)阿莫西林的敏感性。本組資料顯示細(xì)菌對(duì)氨芐西林的耐藥率達(dá)20.9%，產(chǎn)酶率19.8%，提示產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥的主要機(jī)制。此外，在氨芐西林耐藥的HIN菌株中存在一種稱為β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥 (β-lactamase-negative and ampicillin resistant，BLNAR)菌株，主要由于青霉素結(jié)合蛋白的改變和外膜蛋白通透性的下降而介導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生[8]。本組資料中，氨芐西林耐藥的HIN有一株未檢出β內(nèi)酰胺酶，其具體耐藥機(jī)制，是否為BLNAR株有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文認(rèn)為實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重視標(biāo)本直接涂片工作，結(jié)合涂片和培養(yǎng)兩方面的信息可有效的最大程度避免HIN漏檢和假陽性出現(xiàn)，提高HIN感染的分離率和病原學(xué)診斷的準(zhǔn)確性。HIN對(duì)常用抗生素的耐藥率應(yīng)引起臨床醫(yī)師重視，注意合理使用抗菌藥物。

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A

1674-1129(2011)04-0379-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.04.018

顏肇?fù)P，男，41歲，主管技師，畢業(yè)于福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)，從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作，主攻臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)。