劉小玲，周 鴻，于 暉，譚洪濤

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

環(huán)境空氣中尼古丁的高效液相色譜測(cè)定方法

劉小玲，周 鴻，于 暉，譚洪濤

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

目的建立高效液相色譜(HPLC)測(cè)定環(huán)境空氣中尼古丁的方法。方法樣品通過(guò)反相C18柱(150×4.6mm)分離，采用磷酸二氫鉀-乙腈溶液為流動(dòng)相(流速為1ml/min，采用等度洗脫)，通過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)(波長(zhǎng)為260nm)。結(jié)果該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為 0.99993，工作曲線的相關(guān)系數(shù)為 0.9995，檢出限為 4.03×10-3μg/ml，測(cè)定下限為 3.12×10-2μg/ml，對(duì)低、中、高 3濃度尼古丁加標(biāo)回收率為87.4%、88.5%、90.8%，對(duì)低、中、高3濃度尼古丁測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.88%、0.52%、1.1%，對(duì)低、中、高3濃度尼古丁的解吸率測(cè)定分別為92.3%、94.3%、94.6%，以及采樣器中樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，表明11d內(nèi)樣品均穩(wěn)定。結(jié)論該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便，儀器易普及。

高效液相色譜；環(huán)境空氣中尼古?。粰z測(cè)

目前，國(guó)內(nèi)外尼古丁的測(cè)定方法[1-3]有很多種，例如可以采用 LC-MS、LC-MS-MS[4]、GC-MS[5]的方法，但由于這些方法中儀器較昂貴，儀器保有量很低，無(wú)法在基層單位推廣。由于用高效液相色譜檢測(cè)尼古丁的方法具有靈敏度高，重現(xiàn)性好，且儀器易普及的特點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)室推廣使用。因?yàn)楸痉椒ú粌H可以監(jiān)測(cè)環(huán)境空氣中尼古丁的濃度，還可以測(cè)定人體生物樣品如尿液[6]、唾液[7]和頭發(fā)[8]中的尼古丁含量，從而可以比較準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)人群的暴露水平，為制訂科學(xué)的控?zé)煷胧┘霸u(píng)價(jià)控?zé)熜Ч峁┘夹g(shù)支持。

材料與方法

1 方法原理 環(huán)境中氣態(tài)尼古丁采用被動(dòng)式采樣器采樣，采樣后將4%NaHSO4-5%甘油溶液浸漬的玻璃纖維濾膜經(jīng)氫氧化鈉洗脫和正庚烷萃取，在萃取液中加鹽酸混勻，用氮吹儀吹至近干，用1ml流動(dòng)相定容。使用C18反相色譜柱分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，以保留時(shí)間定性，以峰面積定量。

2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料 LC-20A型高效液相色譜儀，快速混勻器，超聲波清洗器，TTL-DCⅡ型氮吹儀，玻璃纖維濾膜(d=42mm)，被動(dòng)式采樣殼體(由中疾控提供)，10μl和 50μl微型注射器，1.5ml樣品瓶

2.3 實(shí)驗(yàn)試劑 尼古丁(標(biāo)準(zhǔn)品)，磷酸二氫鉀(分析純)，磷酸(分析純)，鹽酸(分析純)，乙腈(色譜純)，庚烷磺酸鈉(色譜純)，正庚烷(色譜純)，甘油(分析純)，氫氧化鈉(分析純)。

3 樣品采集

3.1 尼古丁吸收液的配置 準(zhǔn)確稱量20.0g NaHSO4和25.0g甘油，用純水定容于500ml，配制成4%NaHSO4-5%甘油的尼古丁吸收液。

3.2 濾膜制備 選擇合格濾膜，對(duì)光檢查無(wú)針孔或折縫；將玻璃纖維濾膜在馬弗爐中450℃烘烤2h，放入干燥器中冷卻至室溫；從干燥器中取出玻璃纖維濾膜，用尼古丁吸收液浸漬0.5h后，取出置于干燥器中晾干備用。

3.3 采樣器安裝 被動(dòng)式采樣器由殼體、擋風(fēng)層和吸收層組成。殼體包括前蓋、壓環(huán)、托板和底座，擋風(fēng)層為核孔濾膜和滌綸紗網(wǎng)，吸收層為浸漬尼古丁吸收液的玻璃纖維濾膜。安裝好采樣器后，放入鋁箔袋中，封口。

4 實(shí)驗(yàn)分析步驟

4.1 流動(dòng)相的制備 準(zhǔn)確稱取1.09g磷酸二氫鉀，用超純水溶解至接近于1L，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3，定容至1L，準(zhǔn)確加入0.0082g庚烷磺酸鈉，混勻，通過(guò)0.45μm過(guò)濾膜過(guò)濾，制得的磷酸二氫鉀溶液與乙腈比例為9∶1混勻。

4.2 色譜條件 色譜柱為Vp-C18柱 (150×4.6mm)，柱溫為 25℃，SPD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，流動(dòng)相流速為1ml/min。

4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 準(zhǔn)確稱取10.1mg(99%的尼古丁)于10ml容量瓶中，加入流動(dòng)相定容，超聲3min，配成 1.0μg/μl的尼古丁(Ⅰ)液，取(Ⅰ)液 1ml于 10ml容量瓶中，用流動(dòng)相定容，得0.1μg/μl的尼古丁(Ⅱ)液。

4.4 尼古丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別移取尼古丁(Ⅱ) 液 5μl、10μl準(zhǔn)確加入 1ml流動(dòng)相， 混勻，得0.5μg/ml、1μg/ml。 又分別移取尼古丁 (Ⅰ) 液 2μl、4μl、 8μl、16μl準(zhǔn)確加入 1ml流動(dòng)相，混勻，得 2μg/ml、 4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml標(biāo)準(zhǔn)系列，得到尼古丁的標(biāo)準(zhǔn)系列分別進(jìn)樣5μl進(jìn)行分析，各點(diǎn)進(jìn)樣3次，各點(diǎn)對(duì)應(yīng)峰面積取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo),繪制峰面積和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.5 尼古丁工作曲線的制備 分別移取尼古丁(Ⅱ)液 5μl、10μl，移取尼古丁(Ⅰ)液 2μl、 4μl、 8μl、16μl置于制備好的玻璃纖維濾膜上，分別放于10ml比色管中，各加入5.0ml1.5mol/L的NaOH和準(zhǔn)確加入2.0ml正庚烷充分混勻后在恒溫65℃超聲30min，取出于漩渦混勻器上，混勻3min，取正庚烷層(1.8ml)，加 10μl鹽酸，65℃超聲混勻 3min，漩渦2min，氮吹近干，用1ml流動(dòng)相定容，65℃水浴超聲3min漩渦2min徹底解析出尼古丁。分別進(jìn)樣5μl進(jìn)行分析，各點(diǎn)進(jìn)樣3次，各點(diǎn)對(duì)應(yīng)峰面積取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制峰面積和濃度的工作曲線。

4.6 樣品處理 將樣品取回后，取出內(nèi)裝的玻璃纖維濾膜，置于10.0ml比色管中，各加入5.0ml 1.5mol/LNaOH和準(zhǔn)確加入2.0ml正庚烷充分混勻后在恒溫65℃超聲30min，取出于漩渦混勻器上，混勻3min，取正庚烷層(1.8ml)，加 10μl鹽酸 65℃超聲混勻3min，漩渦2min，氮吹近干，用1ml流動(dòng)相定容，65℃水浴超聲3min漩渦2min徹底解析出尼古丁。進(jìn)樣5μl測(cè)定，根據(jù)尼古丁工作曲線的回歸方程計(jì)算膜上的尼古丁含量。采樣放置某辦公室4d，取回采樣器測(cè)定樣品結(jié)果。

結(jié) 果

1 尼古丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

做得的曲線線性方程為y=0.0001932x-0.03952，線性相關(guān)系數(shù) γ=0.99993。

2 尼古丁工作曲線

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

做得的曲線線性方程為y=6.36×10-4x－0.1492，線性相關(guān)系數(shù)γ=0.9995

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 檢出限及測(cè)定下限

連續(xù)測(cè)定10次空白濃度的溶液，計(jì)算響應(yīng)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)差所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度為檢出限，以10倍標(biāo)準(zhǔn)差所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度為測(cè)定下限。10次測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

平均值=19.08， 標(biāo)準(zhǔn)偏差 S=20.4，3S=61.2 10S=204

根據(jù)回歸方程f(x)=0.000190111x－0.00760803

檢出限：f(x)=0.000190111×61.2－0.00760803＝4.03×10-3μg/ml

檢出下限：f(x)=0.000190111×204－0.00760803＝3.12×10-2μg/ml

表2 工作曲線

圖2 工作曲線

表3 檢出限及測(cè)定下限

4 精密度測(cè)試

移取尼古丁(Ⅱ)液 10μl、尼古丁(Ⅰ)液 4μl、8μl準(zhǔn)確加入1ml流動(dòng)相， 混勻， 得1μg/ml、 4μg/ml、8μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣5μl進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定6次，結(jié)果如表4。

表4 精密度測(cè)試

5 準(zhǔn)確度的測(cè)試

在現(xiàn)場(chǎng)樣品中，加入高、中、低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液 (1μl即 1μg/ml，4μg/ml，8μg/ml) 按 4.6 樣品處理，然后測(cè)定樣品溶液和加標(biāo)溶液，各測(cè)定3次，由平均值計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

6 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制濃度為1μg/ml和4μg/ml兩標(biāo)準(zhǔn)溶液，分兩組分別注入12個(gè)濾膜中，采樣器密封后，分別在當(dāng)天、第 3d、第 5d、第 7d、第 9d、第 11d 測(cè)定，每天測(cè)定3個(gè)樣品，按下列公式計(jì)算下降率，以下降率≤10%的天數(shù)為穩(wěn)定時(shí)間，由表6和表7可見(jiàn)，本方法樣品的穩(wěn)定時(shí)間至少為11d。

表5 準(zhǔn)確度測(cè)試

表6 濃度為1μg/ml穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表7 濃度為4μg/ml穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

7 解吸效率測(cè)試實(shí)驗(yàn)

取9個(gè)10ml試管，分別向每3個(gè)試管中加入濃度為 0.8μg/ml、4μg/ml、7.2μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液， 又取 9個(gè) 10ml試管， 分別將 3 個(gè)加有 0.8μg/ml、4μg/ml、7.2μg/ml濃度尼古丁的濾膜放入，然后分別于18支試管中各加入5ml1.5mol/LNaOH，2.0ml正庚烷65℃超聲30min，漩渦混勻3min，取出正庚烷層(1.8ml)，加入10μl鹽酸，氮吹，加1ml流動(dòng)相定容，65℃水浴超聲3min漩渦2min徹底解析出尼古丁。過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)樣5μl，同時(shí)做試劑空白和濾膜空白。結(jié)果見(jiàn)表 8、表 9、表 10。

討 論

該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度好，但由于尼古丁與水有很好的互溶性，所以用1.5mol/L NaOH水溶液能很好的洗脫濾膜上的尼古丁，但是用正庚烷萃取NaOH水溶液中的尼古丁時(shí)，雖然提高溫度(65℃)可以提高萃取率，但仍然不能完全萃取(只能達(dá)到約85～90%的回收率)。測(cè)定時(shí)可做工作曲線消除損失，取出正庚烷層時(shí)加入鹽酸10μl一定要讓鹽酸與尼古丁充分反應(yīng)生成尼古丁鹽，氮吹后加入流動(dòng)相要讓尼古丁鹽充分解析出尼古丁，這樣可以得到很好的回收率。

表8 解吸率測(cè)試實(shí)驗(yàn)(加入濃度0.8μg/ml)

表9 解吸率測(cè)試實(shí)驗(yàn)(加入濃度4.0μg/ml)

表10 解吸率測(cè)試實(shí)驗(yàn)(加入濃度7.2μg/ml)

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Determination of nicotine in the ambient air by high performance liquid chromatography

LIU Xiaoling,ZHOU Hong,YU Hui,et al.Center of Disease Control and Prevention of Jiangxi province,Nanchang 330029,China

ObjectiveTo establish high performance liquid chromatographic(HPLC)assay for the determination of nicotine in the air.MethodsThe sample was separated by reversed-phase C18 column(150×4.6mm)using the potassium dihydrogen phosphate-acetonitrile solution as mobile phase (with flow velocity of 1ml/min,used isocratic elution),and detected by ultraviolet array detector at 260nm.ResultsThe correlation coefficient of the standard curve was 0.99993,and the working curve was 0.9995.Limit of detection was 4.03×10-3μg/ml and limit of quantification was 3.12×10-2μg/ml for nicotine.For the spiked samples of the low,medium and high concentration of nicotine,the recoveries were 87.4%,88.5%and 90.8%,the relative standard deviations were 0.88%,0.52%and 1.1%and the desorption rates were 92.3%,94.3%and 94.6%,respectively.Nicotine test indicated stable in 11 days with determining the sample stability.Conclusions This method is of high sensitivity,better RSD and simple operation,and the instrument can be easily popularized.

High-performance liquid chromatographic;Nicotine in air;Detection

R122.1+1

A

1674-1129(2011)01-0015-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.01.006

國(guó)家科技支撐計(jì)劃，課題編號(hào)：2008AI56B07

劉小玲，女，1961年11月出生，江西玉山縣人，副主任技師，畢業(yè)于江西大學(xué)化學(xué)系，從事衛(wèi)生檢驗(yàn)，主攻理化檢驗(yàn)。