張波,殷燕

木糖異構(gòu)酶 (xyloseisomerase,XI,EC 5.31.1.5),又稱葡萄糖異構(gòu)酶,此酶在細胞內(nèi)可將五碳糖D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖,在微生物體內(nèi)的糖代謝過程中起著重要的作用。在體外可轉(zhuǎn)化葡萄糖形成果糖,并已經(jīng)用于高果糖漿的工業(yè)生產(chǎn),是一種重要的工業(yè)用酶。目前用于生產(chǎn)的木糖異構(gòu)酶多來自Streptom yces,Actinoplanes,Flavobacterium等常溫菌,其催化產(chǎn)物需要借助層析等濃縮步驟方可得到 55%的高果糖漿[1]。若能升高異構(gòu)化反應的溫度則有利于反應向著果糖生成的方向移動。因此尋找和開發(fā)耐熱木糖異構(gòu)酶有望減少生產(chǎn)步驟,直接獲得高果糖漿[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),在一定條件下木糖異構(gòu)酶還可催化生產(chǎn)許多制藥工業(yè)重要的原料稀有糖,如核糖、甘露糖、阿拉伯糖、來蘇糖等。對于高溫菌產(chǎn)生的木糖異構(gòu)酶,Kitada[3]報道了 1株B acillusTX-3可以在 55℃下生產(chǎn)木糖異構(gòu)酶,酶的最適反應溫度達到80℃;Lehmacher[4]也報道了,在 85℃催化異構(gòu)化反應的嗜熱酶,但國內(nèi)相關研究較少。本文研究了 1株從云南騰沖溫泉水樣中篩選的嗜熱菌 (Anoxybacillus flavither m us)所產(chǎn)木糖異構(gòu)酶的分離純化以及酶學性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與培養(yǎng)基

嗜熱菌Anoxybacillus flavither m usWL,分離自云南騰沖溫泉[5]。

培養(yǎng)基:木糖 10 g,蛋白胨 2 g,酵母提取物 2 g,Na2S2O3·5H2O 1 g,Na2S·9H2O 0.3 g,MgSO40.2 g,無機鹽溶液 10 mL,定容至 1 L,pH 7.5。

無機鹽溶液:MnSO4· H2O 0.5 g,CuSO4·5H2O 0.01 g,CoCl2·6H2O 0.045 g,FeSO4·7H2O 0.1 g,ZnSO4· 7H2O 0.5 g,定容至 1 L。

固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉 17.0 g,115℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

1.2 木糖異構(gòu)酶活性測定方法

采用半胱氨酸-咔唑法測定酶活性[6]:0.1 mol/LD-木糖 50μL,酶液 50μL,10 mmol/L MgCl250μL,85℃反應 15 min,沸水浴終止反應。取 100μL立即加入 13 mol/L的 H2SO46 mL,1.5%半胱氨酸鹽酸鹽溶液 0.2 mL,0.12%咔唑酒精溶液 0.2 mL,混勻,室溫放置 2 h,于 540 nm處測定光吸收。據(jù)木酮糖標準曲線求得木酮糖量。酶活單位定義為:每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol木酮糖的酶量為 1個酶活力單位。

1.3 粗酶液制備及酶的純化

1.3.1 粗酶液的制備

取發(fā)酵液離心收集菌體,用 5 mmol/L Tris-HC1(pH 7.5)離心洗滌 2次,菌體重新懸浮于緩沖液中,低溫超聲波破碎細胞 20 min,離心 (4℃ 10 000 r/min),上清液即為粗酶液。

1.3.2 木糖異構(gòu)酶的分離純化

硫酸銨沉淀得到粗酶制品。酶的純化步驟為:首先采用 Sephadex G-75凝膠過濾對粗酶進行純化,然后再進行兩步陰離子交換層析來進行進一步的純化(第一步陰離子交換層析柱分離采用纖維素 DE-52弱陰離子交換柱,第二步陰離子交換層析柱分離采用Q Sepharose Fast Flow強陰離子交換柱離子交換層析)。用溶于相同緩沖液的 0～1.0 mol/L NaCl鹽溶液進行梯度洗脫,收集活性峰,測定蛋白濃度和酶活,酶液冷凍干燥后溶于 pH7.5,20 mmol/LTris-HCl緩沖液中透析 18h后上 QSFF柱。20 mmol/L,pH7.5的 Tris-HCl緩沖溶液作為初始緩沖液,流速 0.5 mL/min,0～1.0 mol/L NaCl鹽溶液進行梯度洗脫,收集活性峰,測定蛋白濃度和酶活。純化后的樣品置-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 SDS-PAGE和 Native-PAGE電泳

Native-PAGE電泳又稱未變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù),即在不加入 SDS、疏基乙醇等變性劑的條件下對保持活性的蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,這樣可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷,尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性。電泳后分別剪下酶條帶,用 pH7.5,20 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗滌 3次,研缽碾碎,樣品加入適量 pH7.5,20 mmol/L Tris-HCl緩沖液,4℃下浸泡 24h,10 000 r/min離心 10 min除去凝膠,上清液即為純酶溶液,測定蛋白濃度和酶活。

SDS-PAGE電泳又稱變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)。取酶液進行 SDS-PAGE電泳。樣品 10 000 r/min離心 10 min后取上清液上樣,進樣量 25μL。具體操作條件和步驟見文獻[7]。

1.3.4 木糖異構(gòu)酶酶學性質(zhì)的研究

木糖異構(gòu)酶最適反應溫度的測定:反應溫度分別為 40、50、60、70、75、80、85、90、95℃,測定酶活性。

木糖異構(gòu)酶最適反應 pH的測定:反應的緩沖液pH分別為 pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,測定酶活性。

金屬離子對酶活性的影響:分別向酶和底物的反應體系中加入終濃度為 0.5 mmol/L的 ZnSO4、CaCl2、CoCl2、MgSO4、FeSO4、AlCl3、CuSO4代替之前的 Mn-SO4,測定酶活性,同時以不添加金屬離子的為對照組。

木糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的測定:將酶液分別在 40、50、60、70、75、80、85、90、95℃保溫 1h后測定剩余酶活力,研究該酶的熱穩(wěn)定性。

木糖異構(gòu)酶酸堿穩(wěn)定性的測定:將酶液分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0緩沖液中 60℃保溫 1h后測定剩余酶活力,研究該酶的酸堿穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖異構(gòu)酶的分離純化

來源于Anoxybacillus flavither m usWL的木糖異構(gòu)酶,經(jīng)過硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析、兩步陰離子交換層析后,檢測蛋白濃度和酶活,酶的純化倍數(shù)約為7.9倍。結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 菌株WL XI Sephadex G-75凝膠過濾層析譜圖

圖2 菌株WL XI纖維素 DE-52離子交換層析

圖3 菌株WL XIQ Sepharose Fast Flow離子交換層析譜圖

2.2 木糖異構(gòu)酶的 SDS-PAGE和 Native-PAGE電泳分析

圖4 為各級純化處理酶液與標準蛋白在同一條件下進行的 Native-PAGE電泳圖譜,其中條帶 4顯示的是 2步陰離子交換層析分離純化得到的 3條蛋白帶。將此 3條蛋白帶分別剪下取出,分別測定木糖異構(gòu)酶活性,其中分子質(zhì)量為 181 ku的蛋白帶具有木糖異構(gòu)酶活性 (酶活測定為 12U/mg),其他 2條蛋白帶無木糖異構(gòu)酶活性,表明條帶 4中分子量約為 181 ku的蛋白帶為木糖異構(gòu)酶,結(jié)果見圖4。經(jīng) Native-PAGE電泳后分離得到的木糖異構(gòu)酶蛋白與標準蛋白在同一條件下進行 SDS-PAGE電泳,與標準蛋白的分子量比較,酶的分子質(zhì)量約為 45 ku,結(jié)果見圖5。綜合圖4和圖5的結(jié)果表明,該酶蛋白分子質(zhì)量約為181 ku,由 4個分子質(zhì)量約為 45 ku的亞基組成。

圖4 XINative-PAGE電泳圖譜

圖5 XI SDS-PAGE電泳圖譜

2.3 木糖異構(gòu)酶的的酶學性質(zhì)

2.3.1 溫度對酶活性的影響

由圖6可知,酶反應的最適溫度為 80℃,在較低溫度下該酶的活性很低。

2.3.2 pH值對酶活性的影響

由圖7可知,pH值 4.0至 pH值 5.0時,酶活極低,而 pH 5.0至 pH 6.0時,酶活急劇上升,pH7.0至pH 8.0時,酶活處于穩(wěn)定狀態(tài)。從 pH 8.0開始酶活降低但至 pH 11.0時酶活仍保持較高水平。酶的最適 pH約在 7.0左右。

2.3.3 木糖異構(gòu)酶穩(wěn)定性研究

圖6 溫度對 XI活性的影響

圖7 pH對 XI活性的影響

木糖異構(gòu)酶分別在不同的溫度下水浴保溫 1h后的剩余酶活如圖8所示,在無底物存在的條件下,60℃保溫 1 h后酶活仍保持近 100%,70℃保溫 1 h后酶活仍能保持近 80%,但在 70℃以上,隨溫度上升酶活性明顯下降,至 80℃時酶活性幾乎全部消失。

圖8 XI的熱穩(wěn)定性

木糖異構(gòu)酶分別在不同 pH的緩沖液中無底物存在的條件下,保溫 1 h后的剩余酶活如圖9所示,pH 4.0時酶活很低,隨 pH增大酶活性明顯上升,pH 5.0時酶活近 100%。pH 5.0至 pH 8.0之間酶活性穩(wěn)定保持在 80%以上,在 pH 9.0以上,隨 pH增大酶活性明顯下降,但直到 pH 12.0時酶活性仍能保持40%左右。

2.3.4 金屬離子對木糖異構(gòu)酶活性的影響

添加不同的金屬離子對菌株Anoxybacillus flavither m usWL木糖異構(gòu)酶活性的影響見表1,Ca2+、Co2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+均對酶活有促進作用 ,尤以Mn2+和 Co2+對酶活的促進作用明顯,Zn2+、Cu2+以及 Al3+對酶活有一定程度的抑制作用。

圖9 XI的酸堿穩(wěn)定性

表1 金屬離子對酶活性的影響

3 討論

木糖異構(gòu)酶作為微生物利用木糖的關鍵酶一直受到國內(nèi)外的關注。目前國內(nèi)外已報道的 XI分子量通常在 180-200 ku。如從Streptom ycessp.SK中分離得到的葡萄糖異構(gòu)酶分子量在 180 ku左右,由 4個相同分子量的亞基組成,屬于分子量較小的一類[8];從Clostridium ther m osulfurogenes和Ther m oanaerobacter等分離得到的葡萄糖異構(gòu)酶均為分子量 200 ku的同型四聚物,分子量相對較大[9-10]。本實驗從嗜熱菌Anoxybacillus flavither m us分離得到的木糖異構(gòu)酶,分子量約 181 ku,由 4個相同分子量的亞基組成。具有極好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性,70℃保溫 1 h后酶活仍能保持近 80%,pH5.0～pH8.0范圍內(nèi)酶活性保持在 80%以上。當前谷物轉(zhuǎn)化為果糖糖漿主要是采用中溫型微生物的葡糖異構(gòu)酶將葡萄糖異構(gòu)化為果糖,但中溫型微生物的葡糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性不高,最適作用溫度為 60℃,在這個溫度下果糖產(chǎn)量不高。目前已從嗜熱菌中分離了一些熱穩(wěn)定的木糖異構(gòu)酶,并進行了研究。如 1997年 Park[11]等從Ther m us favusAT62中分離純化了一種木糖異構(gòu)酶 (XylA),該酶為一種四聚體,其分子量為 185 ku,最適作用溫度為90℃,最適 pH值 7.0,其催化活性需要二價陽離子如Mn2+、Co2+和Mg2+的存在。嗜熱古細菌菌株 JWPSL2YS 489能產(chǎn)生一種分子質(zhì)量為 200 ku的木糖異構(gòu)酶,其催化活性同樣需要二價陽離子如Mn2+、Co2+和Mg2+的存在。在缺少底物的情況下,82℃處理 1 h該酶仍然穩(wěn)定[12]。從T.m aritim a分離純化得到的熱穩(wěn)定性葡萄糖異構(gòu)酶,當溫度達到 100℃時,其活性保持不變;當溫度繼續(xù)上升到 115℃時,10 min后仍有 50%的酶活[13]。雖然嗜熱菌所產(chǎn)生的酶耐高溫,適合于高溫條件的工業(yè)生產(chǎn),但要使之用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)還存在一些目前尚未解決的問題,如一般嗜熱微生物培養(yǎng)條件比較苛刻;大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)需要特殊的設備;產(chǎn)酶效率較低等等。這些因素限制了它們的應用。還需要通過各種方法和手段從極端環(huán)境中篩選,或通過育種,或采用分子生物學手段等得到抗性更強、酶活更高的嗜熱酶生產(chǎn)菌株,從而實現(xiàn)耐高溫木糖異構(gòu)酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應用。本實驗篩選的嗜熱菌Anoxybacillus flavither m usWL生長快,容易培養(yǎng),產(chǎn)生的木糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性良好,有望用于生產(chǎn)和應用。

4 結(jié)論

本課題研究的嗜熱菌所產(chǎn)的酶為木糖異構(gòu)酶,分子量為 181ku,由 4個相同分子質(zhì)量的亞基組成。酶的最適反應溫度為 80℃,最適 pH值 7.0。70℃保溫1h后,酶活保持近 80%,pH5.0～pH8.0內(nèi)保溫 1h,酶活保持 80%以上。Mn2+和 Co2+對酶活性有明顯促進作用。Zn2+、Cu2+、Al3+對酶活有一定程度的控制。

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