劉俊劭 江慧華 林志鑾 陳培珍

（福建省高校綠色化工技術重點實驗室，武夷學院環(huán)境與建筑工程系，福建 武夷山 354300）

毛細管氣相色譜法測定金錢草莖葉中多糖的單糖組成

劉俊劭 江慧華 林志鑾 陳培珍

（福建省高校綠色化工技術重點實驗室，武夷學院環(huán)境與建筑工程系，福建 武夷山 354300）

金錢草多糖經(jīng)三氟乙酸水解、后利用二甲基亞砜（DMSO）作溶劑，六甲基二硅胺烷（TMDS）和三甲基氯硅烷（TMCS）作硅烷化試劑，將單糖衍生化為三甲基硅醚衍生物，用氣相色譜（GC）分析法測定金錢草葉和根莖中多糖的單糖組成。結果表明：金錢草葉和根莖中多糖都是由甘露糖、果糖、核糖、半乳糖、鼠李糖和樹膠醛糖單糖組成，其摩爾比分別為1.40:1.00:1.00:4.68:0.98:0.46和1.03:1.00:1.04:1.66:0.56:0.44。

金錢草;單糖;毛細管氣相色譜法

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質(zhì)。廣泛存在于動物細胞膜和植物、微生物的細胞壁中，近年來研究發(fā)現(xiàn)多糖類化合物具有抗腫瘤和增強免疫作用的功效，引起醫(yī)學界極大的重視。金錢草為報春花科（Primulaceae）珍珠菜屬，在我國分布廣泛。金錢草味苦、酸、微寒，功能清熱解毒、利尿排石、活血散瘀，用于治療肝膽結石，膽囊炎，黃疸性肝炎，水腫，跌打損傷，毒蛇咬傷，毒蕈及藥物中毒，化膿性炎癥燒燙傷等癥[1-3]。據(jù)研究報道，金錢草的多糖具有除刺激免疫器官增重和淋巴細胞增加的功能，說明金錢草多糖可能具有的抗腫瘤作用[4]。

本研究通過金錢草的多糖水解，衍生化后，進行氣相色譜GC分析，研究其單糖的組成及含量，為進一步研究其藥理活性和機制提供物質(zhì)基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑及原材料

所用的標準單糖：葡萄糖、D-核糖、L-樹膠醛糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖、鼠李糖，均為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；濃硫酸、苯酚、石油醚、無水乙醇、氯仿、三氟乙酸、三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、二甲基亞砜等試劑均為AR；金錢草來自武夷山地區(qū)，經(jīng)武夷學院綠色化工技術重點實驗室賈劍暉實驗師鑒定。

1.1.2 主要儀器

島津GC－14C氣相色譜儀；島津AA-6300F紫外可見分光光度計

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法

1、提取 稱取粉碎的金錢草干葉和干莖分別用石油醚回流2小時，除去溶劑，再用80%乙醇回流提取2小時，以除去脂類物質(zhì)，然后除去醇液，水煎1.5h重復3次，取水煎液濃縮，用氯仿萃取，水層中多糖用乙醇洗脫，過濾乙醇，沉淀物用丙酮和無水乙醇反復洗滌以去除鞣質(zhì)，烘干，再用超純水溶解，用微孔濾紙抽濾后于旋轉蒸發(fā)儀里濃縮，取濃縮液烘干。

2、sevage法脫蛋白 金錢草多糖脫蛋白參考文獻[5]

3、干燥稱量計算粗多糖的提取率。

1.2.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量[6,7]

準確稱取標準葡萄糖10.3mg于250 ml容量瓶中，加水至到刻度，分別吸取 0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0 mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL 及 1.8mL，各以蒸餾水補至2.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，靜止10分鐘，搖勻，室溫放置20分鐘后，于490 nm測吸光度，以2.0mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白，以橫坐標為多糖微克數(shù)，縱坐標為吸光度值。葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 以葡萄糖為標準溶液的總糖測定曲線Fig1 The standard curve of glucose

準確稱量金錢草葉多糖和根莖多糖于250ml容量瓶中，加水至到刻度，按上述步聚配置溶液，分別以同樣的方法進行測吸光度值。測定粗多糖中多糖的含量。

1.2.3 衍生化法測定單糖

1、標準單糖衍生化 準確稱取D-核糖、L-樹膠醛糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖、鼠李糖、肌醇各300mg，溶解后，轉移于100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制得標準溶液。用移液管準確移取標準溶液2mL，在80℃水浴中真空蒸干。在蒸干的標準樣中加入2mL的二甲基亞砜（DMSO），在超聲波中振蕩使之溶解。溶解后加入2mL的六甲基二硅胺烷（HMDS）和 1mL 的三甲基氯硅烷（TMCS），進行衍生化。分離上層液，過濾供氣相色譜分析。

2、樣品的水解 稱取金錢草莖多糖和金錢草葉多糖各一份，分別置于水解管中，溶解在5mL的2M的三氟乙酸（TFA）溶液中，100℃氮氣保護下水解4h，減壓濃縮至干。

3、樣品的衍生化 分別取金錢草根莖和葉的水解樣加入內(nèi)標物肌醇，然后用2mL的二甲基亞砜（DMSO），在超聲波中振蕩使之溶解。溶解后加入2mL的六甲基二硅胺烷（HMDS）和1mL的三甲基氯硅烷（TMCS），進行衍生化。衍生化后單糖轉變?yōu)槿谆杳蜒苌?。分離上層液，過濾供氣相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 金錢草多糖的含量

經(jīng)過浸泡、熱提、醇析等方法提取金錢草中的多糖成分，沉淀除蛋白質(zhì)后，采用硫酸苯酚法測定其多糖含量，結果見表1。

表1 金錢草多糖的提取率Table 1 The extraction rate of polysaccharide

2.2 金錢草單糖的測定

2.2.1 氣相色譜條件

色譜柱：毛細管柱 CBP1-M25-0.25，25m×0.25μm，氫火焰離子化檢測器，載氣 N2，流速30 mL/min，進樣量0.1μL，進樣溫度230℃，F(xiàn)ID檢測器溫度230℃，柱溫度 195℃。

2.2.2 定性定量分析

按上述色譜條件分別對標準溶液、葉和根莖樣品溶液進行測定，以標準品定性，內(nèi)標法定量，標準混合單糖、葉多糖和根莖多糖的色譜圖分別見圖2、圖3、圖4。

圖2 標準單糖衍生化產(chǎn)物的GC分析Fig.2 Gas chromatogram of standard sugar

圖3 金錢草根莖單糖氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of the monosaccharide of rhizome

圖4 金錢草葉單糖氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of the monosaccharide of leaf

2.3 討論

由于單糖本身沒有足夠的揮發(fā)性，必須預先轉化成易揮發(fā)、對熱較穩(wěn)定的衍生物才能采用氣相色譜進行分析。由于單糖的異構化，在衍生化制備過程中，易產(chǎn)生衍生物的異構體，為此，一種單糖得到的往往不是出一個色譜峰[8,9]。單糖的定性是用各種單糖的標準樣品衍生化后，用氣相色譜分別測定每種單糖的色譜峰和保留時間，由此定性分析金錢草樣品中單糖的種數(shù)。單糖含量的定量計算，采用內(nèi)標法計算，本文以肌醇為內(nèi)標物。

3 結論

（1）金錢草葉多糖的提取率高于根莖的提取率。金錢草葉多糖總提取率為2.40%（干品），根莖多糖總提取率為1.66%（干品）。

（2）金錢草的根莖和葉都含有甘露糖、果糖、核糖、半乳糖、鼠李糖和樹膠醛糖，其中含量最多的是半乳糖，根莖和葉各種單糖比例為甘露糖：果糖：核糖：半乳糖：鼠李糖：樹膠醛糖為 1.03：1.00：1.04：1.66：0.56：0.44 和 1.40：1.00：1.00：4.68：0.98：0.46。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 [M].北京:化學工業(yè)出版社,2000年版一部：176.

[2]劉雋,鄒國林.金錢草的研究進展 [J].唐山師范學院學報,2002,24(002):8-10.

[3]張兆瑞,張屹立,張光早,等.金錢草應用淺析 [J].丹東醫(yī)藥,2005,003):39-40.

[4]趙武述,張玉琴,趙世琴.黃芪脂多糖,金錢草多糖和山茱萸糖促進免疫作用的研究[J].中日友好醫(yī)院學報,1989,3(4):194-198.

[5]穆文靜,杜玲,扈瑞平,等.鈍頂螺旋藻多糖 Sevage法脫蛋白工藝的研究[J].內(nèi)蒙古石油化工,2011,10):1-4.

[6]林志鑾,劉俊劭.3,5-二硝基水楊酸法測定金錢草多糖的研究[J].云南民族大學學報:自然科學版,2011,20(2):89-91.

[7]劉俊劭,林志鑾.兩種分光光度法測定金錢草中多糖含量的研究[J].洛陽師范學院學報,2011,30(002):48-50.

[8]姜波,關紫烽,白松濤,等.采用 GC法分析苦丁茶中可溶性單糖的研究[J].茶葉科學,2006,26(3):195-198.

[9]張惟杰主編.復合多糖生化研究技術 [M].上海：上?？茖W技術出版社,1987.

Determination of Monose in the Stems and Leaves of Lysimachia Christinae Hance by Capillary Chromatograph

LIU Junshao JIANG Huihua LIN Zhiluan CHEN Peizhen

(Key Laboratory for Green Chemical Engineering Technology of Fujian Higher Education Department of Environmental and Architectural Engineering，Wuyi University，F(xiàn)ujian 354300)

Polysaccharide of Lysimachia christinae Hance is hydrolyzed by trifluoroacetic acid.The hydrolysate was derived into trimethylsilylethers derivative with hexamethyedisilane(HMDS)and trimethylchlorosilane(TMCS)as silanizing agent,and dimethyl sulfoxide(DMSO)as solvent.The monosaccharide was determined by GC with capillary column.The results showed that the polysaccharide of leaves and stems were composed of mannose,fructose,ribose,galactose,rhamnose and arabinose,and themolar ratio of thosemonose is 1.40:1.00:1.00:4.68:0.98:0.46 and 1.03:1.00:1.04:1.66:0.56:0.44,respectively.

lysimachia christinae hance;monose;capillary chromatograph

R284.1

A

1674－2109(2011)05－0048－04

2011-08-30

武夷學院?？蒲谢鸷Ｎ黜椖?（項目編號：xh201002）；武夷學院對接南平產(chǎn)業(yè)發(fā)展科研專項（項目編號：2011DJ10）

劉俊劭（1971-）男，漢族，講師，碩士，主要研究方向：天然產(chǎn)物提取和分析。