胡秀彩,王 藝,呂愛軍

(徐州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇徐州 221116)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是中國主要食用經(jīng)濟(jì)魚類之一。近年來草魚養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量快速發(fā)展,同時細(xì)菌性病原感染給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。隨著河流、海洋環(huán)境的污染,人畜共患病原菌開始感染魚類,已報(bào)道從魚類等水生動物中分離到氣單胞菌(Aerom onas)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、假單胞菌(Pseudom onas)等多種人畜共患病原菌[2-5]。最近Akoachere等[6]從沿海魚類的腸道、鰓等組織中分離到大腸埃希菌(Escherichiacoli)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter fruendii)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)等人類致病菌,證實(shí)對氨芐青霉素耐藥率達(dá)45.7%。弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)是一種“人-獸-魚”共患病病原菌,可引起人、哺乳動物、魚、鱉、蝦等感染發(fā)病[7-11]。目前關(guān)于魚類腸道中弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定研究,國內(nèi)外鮮有報(bào)道[4]。本研究以草魚為實(shí)驗(yàn)對象,從其腸道中分離到3株弗氏檸檬酸桿菌,并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征、藥敏試驗(yàn)、動物試驗(yàn)、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-single strand conformation polymorphism,SSCP),為魚類疾病診斷防治提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 草魚購自徐州市某菜市場,隨機(jī)選取體重約500 g左右的草魚用于細(xì)菌分離;斑馬魚(平均體重約0.25 g)購自徐州市某花鳥市場;小鼠(平均體重22 g)購自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂(MaC)、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、三糖鐵瓊脂(TSI)培養(yǎng)基、常規(guī)細(xì)菌微量生化鑒定管、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-15e、藥敏紙片等購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要試劑 革蘭陰性菌基因組提取試劑盒、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP等購自上海捷瑞生物工程公司,pMD18-T Vector試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、形態(tài)觀察與生化試驗(yàn) 無菌操作取草魚中后部腸道,用無菌生理鹽水沖洗3次,刮取魚腸內(nèi)容物,加無菌生理鹽水于離心管中混勻后300 r/min離心5 min,吸取適量上清液涂布普通營養(yǎng)瓊脂、MaC平板,29℃培養(yǎng)24 h,挑取菌落形態(tài)特征不同的單個菌落進(jìn)行分離純化,獲得純種轉(zhuǎn)接試管斜面培養(yǎng)基上保存、備用。獲得菌株經(jīng)革蘭染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察;同時挑取單菌落,用4%的戊二醛固定1 h,PBS洗3次,再用4%的戊二醛固定30 min,PBS洗3次,乙醇梯度脫水,最后加叔丁醇脫水,在H ITACH I S-3400N掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。取純培養(yǎng)菌,分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂、MaC、EMB、TSI培養(yǎng)基平板,29℃培養(yǎng)24 h,分別檢查生長情況及菌落特征。細(xì)菌微量生化鑒定參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行,并連續(xù)觀察7 d。

1.2.2 細(xì)菌總DNA提取、16S r DNA基因的PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用革蘭陰性菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將3株菌的總DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ钥侱NA為模板,采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增,正向引物:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′,反向引物:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。10μL反應(yīng)體系分別包括:5 U/μL的TaqDNA聚合酶0.1μL,10×buffer 1μL,25 mmol/L的MgCl20.6μL,2.5 mmol/L的dNTP混合物0.2μL,引物各0.3μL,模板DNA 0.4 μL,無菌雙蒸水7.1μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min、94℃變性30 s、57℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min,30個循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α篩選陽性克隆,送上海生工生物工程有限公司測序。將3株菌的16S rDNA基因序列通過NCB I的Blast檢索系統(tǒng)(http://www.1ncbi1nlm1nih1gov/Blast/)進(jìn)行序列同源性分析,使用ClustalX1.8軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的細(xì)菌16S r DNA基因序列進(jìn)行多序列匹配排列(Multiple Alignments),采用鄰接法(Neighbor joiningmethod)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并通過1 000次的自舉分析(boost rap)進(jìn)行置信度檢測。

1.2.3 16S r DNA基因V3區(qū)的PCR-SSCP分析

以總DNA為模板,正向引物:5′-CAGTCACGACGTTGTAA-3′,反向引物5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。10μL反應(yīng)體系包括:5 U/μL的TaqDNA聚合酶0.1μL,10×buffer 1μL,25 mmol/L的MgCl20.6μL,2.5 mmol/L的dNTP混合物0.2μL,引物各0.3μL,模板DNA 0.4μL,無菌雙蒸水7.1μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min、94℃變性30 s、51℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min,30個循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。SSCP分析參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。簡述如下:取6μL的PCR產(chǎn)物,與4μL變性緩沖液混勻,98℃變性10 min后立即冰浴10 min,于10%PAGE中電泳,4℃、180 V電泳2.5 h(Bio-Rad);電泳后先用蒸餾水洗1～2次,0.1%AgNO3染色15 min,然后利用2.0%NaOH(0.2%甲醛)顯色,直至條帶清晰為止;照像并分析SSCP帶型。

1.2.4 動物試驗(yàn)與藥敏試驗(yàn) 小鼠試驗(yàn)以3株菌29℃培養(yǎng)24 h,制備終濃度為9×108cfu/mL的菌液,小鼠腹腔注射0.2 mL,每株細(xì)菌注射3只,觀察7 d,記錄結(jié)果。死亡的小鼠無菌操作取臟器接種營養(yǎng)瓊脂平板上,觀察有無相應(yīng)的細(xì)菌生長。對照組注射無菌生理鹽水,劑量相同;斑馬魚感染實(shí)驗(yàn)分為飼養(yǎng)溫度25、28℃2組,采用菌濃度為108cfu/mL的TC-2菌株進(jìn)行浸泡感染試驗(yàn),浸泡時間為10 min,每組5條斑馬魚,連續(xù)觀察7 d,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,統(tǒng)計(jì)致死率,對照組用等量0.65%氯化鈉溶液同樣處理。藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法,無菌操作將藥敏紙片分別置于含菌LB瓊脂平板上,每種藥3個重復(fù),根據(jù)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn),確定病原菌對不同藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征

3株菌均為革蘭陰性桿菌、無芽胞、大小約為(0.5～1.0)μm×(1.0～2.5)μm,在普通光學(xué)顯微鏡下多呈分散或成對排列,在掃描電鏡觀察3株菌菌體呈桿狀(有的菌體稍彎曲)、2端鈍圓(圖1)。3株分離菌在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈圓形光滑、濕潤、隆起、半透明、乳白色、邊緣整齊,直徑多在1.5 mm;在MaC平板上培養(yǎng)24 h后形成圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的菌落,直徑多在2.0 mm左右,TC-1菌株菌落呈紅色,TC-2菌株菌落呈白色,TC-3菌株菌落呈白色中間帶紅點(diǎn);在EMB平板上培養(yǎng)24 h后形成圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的菌落,TC-1菌株直徑多在1.5 mm,菌落呈紫黑色,TC-2菌株直徑多在1.5 mm,菌落呈灰黑色,TC-3菌株直徑多在1.0 mm,菌落呈灰白色;在TSI平板上培養(yǎng)24 h后形成圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的黃色菌落,直徑多在3.0 mm;TC-1、TC-3菌株在TSI瓊脂高層斜面下部呈黑色、斜面呈黃色,TC-2菌株在TSI瓊脂高層斜面下部呈黑色、斜面呈紅色。

2.2 生化特征

3株菌生化特性結(jié)果見表1,查閱《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[14],結(jié)果表明菌株TC-1、TC-2及TC-3的形態(tài)學(xué)特征和各項(xiàng)生理生化檢測結(jié)果基本符合檸檬酸桿菌屬的特性,初步確定為檸檬酸桿菌屬(Citrobacter);進(jìn)一步查詢腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌生化數(shù)值編碼表,3株菌株鑒定均為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter fruendii)。

圖1 3株分離菌的掃描電鏡照片(標(biāo)尺=0.5μm)Fig.1 Scanning electron micrograph of the three isolated strains(bar=0.5μm)

2.3 菌株16S rDNA序列、PCR-SSCP和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

分離菌株TC-1、TC-2和TC-3 PCR擴(kuò)增的16S rDNA序列長度為1 505 bp,在GenBank中登錄號為HQ399663。將3個分離菌株的16S rDNA基因序列通過NCB I的Blast軟件進(jìn)行序列同源性檢索,結(jié)果其與檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)等腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌的16S r DNA基因序列自然聚類,在檢索出的弗氏檸檬酸桿菌等細(xì)菌序列中,3個分離菌株與弗氏檸檬酸桿菌DS M 30039模式株同源性分別為99.59%、99.47%和99.53%,與其他菌株的同源性在96%～99%,TC-1、TC-2和TC-3均為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii),這與3菌株的生化表型鑒定結(jié)果一致。以弗氏檸檬酸桿菌(AJ233408)16S rDNA基因?yàn)閰⒄招蛄?對3株分離細(xì)菌16S rDNA基因高變區(qū)V3區(qū)序列比對,Blast搜索發(fā)現(xiàn)5個SNP突變位點(diǎn),即449C→T,461T→C,469G→A,471G→A,479C→T;進(jìn)一步采用PCR-SSCP分析表明,菌株TC-1、TC-2和TC-3的16S rDNA V3區(qū)呈現(xiàn)基因多態(tài)性,具有不同的SSCP指紋圖譜,其中TC-1菌株與TC-2、TC-3菌株SSCP帶型明顯不同,菌株TC-2、TC-3之間的SSCP帶型有微弱差異,結(jié)果表明弗氏檸檬酸桿菌SSCP圖譜中菌株之間帶型存在一定差異(圖2),這與16S rDNA V3序列分析結(jié)果一致。在GenBank中選取了其中16株細(xì)菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,結(jié)果顯示3個分離菌株基本屬于同一個分支類群中,其中TC-1菌株與TC-2、TC-3菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn),TC-2與TC-3菌株親緣較近,系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

表1 3株分離細(xì)菌的生化特征Table 1 Biochemical characteristics of the three isolated strains

圖2 3株菌16S rDNA V3區(qū)的PCR-SSCP分析Fig.2 PCR-SSCP analysis of the 16S rDNA V3 region of 3 strains

2.4 動物試驗(yàn)

對3株分離菌株分別進(jìn)行動物感染實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有TC-2菌株對小鼠、斑馬魚有致死性。小鼠在注射24～36 h后全部死亡,死亡率為100%,感染發(fā)病死亡的小鼠腸道黏膜淤血、出血明顯。將TC-2株對斑馬魚浸泡感染試驗(yàn),結(jié)果表明當(dāng)飼養(yǎng)溫度為25℃時,24～96 h致死率為66.7%;當(dāng)飼養(yǎng)溫度升為28℃時,致死率為86.7%。感染發(fā)病死亡的斑馬魚呈現(xiàn)皮膚、腮部出血,腹部膨脹等癥狀。

2.5 藥敏試驗(yàn)

用9類18種藥物對3株菌株進(jìn)行藥物敏感性測試,結(jié)果表明對頭孢噻肟、頭孢曲松、洛美沙星、諾氟沙星等多種藥物敏感,見表2。

圖3 3株菌16S rDNA基因序列構(gòu)建的N J樹(▲代表分離株)Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences of 3 strains(▲indicates the isolates)

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug sensitivity test

3 討 論

弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)為腸桿菌科、檸檬酸桿菌屬的成員,在土壤、水體、污水、食物中廣泛分布,此外在哺乳動物、鳥類、爬行動物和兩棲動物等體內(nèi)也可分離得到,一般認(rèn)為弗氏檸檬酸桿菌是原發(fā)性或繼發(fā)性感染的病原菌[14]。近年來,關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致魚類感染疾病的報(bào)道不斷增加[15-16]。Sato等[17]最早從水族箱養(yǎng)殖的翻車鲀(M ola m ola)分離到弗氏檸檬酸桿菌,感染發(fā)病表現(xiàn)皮膚腐爛、出血、腸炎等癥狀。Toranzo等[18]報(bào)道魚源弗氏檸檬酸桿菌不能導(dǎo)致小鼠感染發(fā)病。Svetlana等[2]報(bào)道弗氏檸檬酸桿菌可引起虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腸炎,導(dǎo)致較高的死亡率。舒新華等[19]報(bào)道弗氏檸檬酸桿菌感染烏鱧(Ophiocephalus argus Cantor)導(dǎo)致腹水病。陳翠珍等[20]研究表明弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis H.Milne-Edwards)感染。本研究從草魚腸道中分離獲得3株弗氏檸檬酸桿菌,其中TC-2菌株對斑馬魚有致病性,感染引起斑馬魚(Danio rerio)皮膚、腮部出血,腹部膨脹等癥狀,并且感染與水溫有關(guān)。因此推測TC-2菌株疑似為草魚腸道中的條件致病菌,有可能由水中進(jìn)入草魚腸道后再大量增殖,在水溫等環(huán)境條件改變時從而導(dǎo)致草魚感染發(fā)病。

陳翠珍等[20]對引起中華絨螯蟹死亡的3株弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示均對頭孢噻肟、頭孢曲松、諾氟沙星、氧氟沙星等藥物敏感;對利福平、頭孢唑啉、新生霉素等耐藥。林啟存等[21]對引起中華鱉(Pelodiscus sinensis)敗血癥的弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果表明對復(fù)方新諾明、四環(huán)素耐藥,而對慶大霉素、丁胺卡那等藥物敏感。Nawaz等[4]對鯰魚(Ictalurus punctatus)腸道中檸檬酸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對利福平、紅霉素等耐藥。本實(shí)驗(yàn)對3株弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),獲得結(jié)果與以上報(bào)道基本一致,但對環(huán)丙沙星、慶大霉素、紅霉素等藥物敏感性存在明顯差異,這可能與臨床用藥導(dǎo)致耐藥菌株不同有關(guān)。以上結(jié)果為臨床治療魚病合理選擇抗生素或減少抗生素濫用提供一定科學(xué)參考。

王永等[22]對常見食源性致瀉大腸埃希菌(D iarrheogenic Escherichiacoli)、沙門菌(Salm onellae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)進(jìn)行SSCP分析,結(jié)果表明4種致病菌16S r DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性具有種屬特異性。羅雯等[23]通過PCR-SSCP等分子技術(shù)快速鑒別了金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(V ibrio parahem olyticus)、痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、銅綠假單胞菌(Pseudom onas aeruginosa)等10種常見病原菌。Schwieger等[24]研究表明PCR-SSCP方法可以應(yīng)用于植物土壤微生物與根際微生物群落分析。Nair等[25]報(bào)道沙門菌(Salm onella)不同的血清型呈現(xiàn)不同的SSCP圖譜。最近,Takahashi等[26]將PCR-SSCP技術(shù)成功用于魚類細(xì)菌的檢測和鑒定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3株弗氏檸檬酸桿菌的SSCP圖譜在條帶數(shù)目、相對遷移率及條帶間距方面,相互間均存在明顯差異,且其差異似與親緣關(guān)系成正比,即親緣關(guān)系越遠(yuǎn),差異越明顯,這與16S rDNA V3區(qū)序列多態(tài)性分析結(jié)果基本一致。SSCP是近年來發(fā)展起來的一種簡便、快速的基因突變分析技術(shù),在動物腸道細(xì)菌鑒定中應(yīng)用較多,目前在魚類中報(bào)道較少[26]。本研究表明弗氏檸檬酸桿菌16S r DNA V3區(qū)的PCR-SSCP圖譜具有很好的菌株鑒別效果,因此在魚類病原菌診斷中值得推廣應(yīng)用。

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