趙沁沁,劉 軍

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

D—氨基酸氧化酶 (DAAO)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)為輔基的黃素酶類[1]。D—氨基酸氧化酶在 D—氨基酸定性定量分析[2]、生物傳感器[2]、D,L-氨基酸混合物的酶法拆分 、抗生素關(guān)鍵原料的生產(chǎn)[3]等方面有重要的應(yīng)用前景。

高效價廉地生產(chǎn)D—氨基酸氧化酶是實現(xiàn)其工業(yè)應(yīng)用的前提。利用野生菌株發(fā)酵產(chǎn)酶成本高,難于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。利用工程菌株生產(chǎn)D—氨基酸氧化酶是得到大量、價廉 D—氨基酸氧化酶的有效途徑。已經(jīng)在多種生物中克隆到D—氨基酸氧化酶基因,包括纖細(xì)紅酵母[4]、變異三角酵母[5]等多種酵母菌。從已報道的文獻(xiàn)來看,來源于變異三角酵母 (Trigonopsis variabilis)的 D—氨基酸氧化酶基因構(gòu)建的工程菌最有希望實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。D—氨基酸氧化酶基因雖已在大腸桿菌、酵母菌中進(jìn)行了表達(dá),但因表達(dá)水平低等原因至今未擴大生產(chǎn)[6]。本研究利用跨內(nèi)含子 PCR技術(shù)從變異三角酵母基因組中克隆其 D—氨基酸氧化酶基因,構(gòu)建表達(dá)變異三角酵母D—氨基酸氧化酶基因的大腸桿菌工程菌株,希望得到表達(dá)水平高、酶活力強的工程菌株,為利用工程菌生產(chǎn)D—氨基酸氧化酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

變異三角酵母 (Trigonopsis variabilis)、大腸桿菌BL21(DE3),為武漢工業(yè)學(xué)院微生物與生物技術(shù)實驗室保存。

1.2 試劑盒和試劑

E.Z.N.A.Yeast DNA Kit購自 Omega公司 ;限制性內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶及 PyrobestT M DNA Polymerase均購自寶生物工程 (大連)有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒,PCR產(chǎn)物回收試劑盒,瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自上海捷瑞生物工程有限公司;丙烯酰胺 (Acr)及甲叉雙丙烯酰胺 (Bis)購自Fluka公司;四甲基乙二胺 (TEMED)購自 Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 PCR引物

參照 Gen Bank中變異三角酵母 D—氨基酸氧化酶基因序列設(shè)計引物,上游引物：5’-CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGGGCCGGTGTTGCCGGTT TAAC-3’,下游引物：5’-CCCAAGCTTCT AAAGGTTTGGACGAG-3’。上游引物和下游引物分別有NcoⅠ和 HindⅢ酶切位點,用下劃線標(biāo)出。

1.4 酵母基因組 DNA提取

用 YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)變異三角酵母,至 OD600值為 10,取 3mL培養(yǎng)物,離心收集菌體,用 E.Z.N.A.YeastDNA Kit提取變異三角酵母基因組 DNA。

1.5 PCR擴增D—氨基酸氧化酶基因

以變異三角酵母基因組 DNA為模板,擴增其D—氨基酸氧化酶基因。PCR反應(yīng)體系 (25μL)：無菌的三蒸水 19μL,10×buffer 2.5μL,上、下游引物各加 0.5μL,dNTP 1μL,Pyrobest DNA Polymerase 0.5μL,基因組 DNA 1μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃5 min;94℃1 min,52℃1 min,72℃1.5 min,30個循環(huán);72℃10min。

1.6 D—氨基酸氧化酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

回收 PCR擴增產(chǎn)物,用 N coI和 HindⅢ雙酶切,瓊脂糖電泳,切膠回收。將 pET-28a質(zhì)粒用 N co I和 HindⅢ雙酶切,回收酶切后的載體。將目的基因與載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3),并涂布在含有卡那霉素的 LB瓊脂平板上;挑取在平板上長出的單菌落培養(yǎng),用 PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子,并測序確證。

1.7 D—氨基酸氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)及 S DS-PAGE分析

將重組菌 37℃培養(yǎng)過夜,接種 1mL菌液于裝有 50mL含卡那霉素的 LB液體培養(yǎng)基的三角瓶(250mL)中,37℃、250 rpm下培養(yǎng)至 OD600值為1.0,加入終濃度為 1mM的 IPTG,對工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá) 5 h,以不加 IPTG的同樣條件下培養(yǎng)的培養(yǎng)物作為對照。SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.8 DAAO酶活的測定

DAAO酶活檢測是根據(jù)酶和 D—氨基酸反應(yīng)生成相應(yīng)的酮酸,酮酸與 2,4-二硝基苯肼反應(yīng),在堿性條件下有可溶性的棕色生成物,在 550nm處可以進(jìn)行定量檢測[7]。

取 1mL發(fā)酵液離心收集菌體。用 1mL pH 8.0的 0.1mol/L的磷酸緩沖液將菌體進(jìn)行重懸,加入 0.1mL100 mmol/L的 D—丙氨酸溶液和 0.1mL的牛肝過氧化氫酶 (400U),37℃水浴反應(yīng) 15min后,加入0.48mL的對硝基苯肼 (2mg/mL)溶液,終止反應(yīng),靜置 10min,加入 1.7mL 3mol/L的 NaCl溶液顯色,于550nm處測定吸光度。DAAO酶活力單位定義為每分鐘氧化脫氨生成 1μmoL酮酸所需要的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增D—氨基酸氧化酶基因

用Omega公司酵母基因組提取試劑盒提取變異三角酵母 (Trigonopsis variabilis)基因組 DNA,參照 GenBank中 D—氨基酸氧化酶基因序列設(shè)計引物,通過 PCR擴增變異三角酵母 D—氨基酸氧化酶基因編碼區(qū)序列,將 PCR產(chǎn)物在 1%瓊脂糖凝膠上電泳,結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴增 D—氨基酸氧化酶基因 (1-2—PCR擴增產(chǎn)物;M—DL-2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn))

從圖1可知,通過 PCR從變異三角酵母基因組中擴增出一條特異性條帶,該條帶約 1100 bp,與變異三角酵母D—氨基酸氧化酶基因編碼區(qū)大小一致。

2.2 D—氨基酸氧化酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將回收的 PCR擴增產(chǎn)物,經(jīng) NcoI和 HindⅢ雙酶切后,瓊脂糖電泳,切膠回收酶切片段。將 pET-28a質(zhì)粒用 NcoI和 HindⅢ雙酶切,回收雙酶切質(zhì)粒。用 T4 DNA ligase將目的基因與載體連接,得到重組質(zhì)粒 pET-28a-DAAO,重組質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3),涂布在含有卡那霉素的 LB瓊脂平板上,挑單克隆培養(yǎng)。用 PCR篩選重組克隆見圖3。

圖2 pET-28a-DAAO重組載體的構(gòu)建

圖3 PCR鑒定陽性克隆 (1—6—隨機挑取的單菌落,M—DL-2000核酸分子標(biāo)準(zhǔn)量)

對 PCR篩選的陽性克隆進(jìn)行測序,Blast結(jié)果表明,所克隆到的序列與 GenBank中變異三角酵母D—氨基酸氧化酶基因編碼區(qū)序列同源性達(dá) 99%以上,表明重組工程菌株BL21(DE3)/pET-28a-DAAO構(gòu)建成功。

2.3 D—氨基酸氧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測定

按常規(guī)方法對工程菌進(jìn)行誘導(dǎo),表達(dá)變異三角酵母 D—氨基酸氧化酶。結(jié)果見圖4。

從圖4可知,重組菌株表達(dá)出分子量為 40 kD的蛋白分子,與預(yù)期的DAAO分子量相一致。

圖4 SDS-PAGE電泳分析 DAAO在重組菌中的表達(dá)2、4—未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的菌;1、3—經(jīng) ITPTG誘導(dǎo) 5h的菌;1、2—來自一個克隆;3、4—來自另一個克隆;M—中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)

對誘導(dǎo) 5 h的重組菌培養(yǎng)物進(jìn)行酶活測定,酶活為 25.2 U/mL,表明所構(gòu)建的工程菌能較高水平表達(dá) D—氨基酸氧化酶。

3 結(jié)論

本研究參照 Gen Bank中D—氨基酸氧化酶基因序列設(shè)計引物,利用跨內(nèi)含子 PCR技術(shù)直接從變異三角酵母 (Trigonopsis variabilis)基因組中擴增變異三角酵母 D—氨基酸氧化酶基因編碼區(qū)序列,成功構(gòu)建了產(chǎn)變異三角酵母D—氨基酸氧化酶的重組工程菌 BL21(DE3)/pET-28a-DAAO。與先提取三角酵母總 RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行 PCR擴增得到 DAAO基因相比,此方法更加簡便[8]。本研究所構(gòu)建大腸桿菌工程菌株表達(dá)水平高,為利用工程菌生產(chǎn) D—氨基酸氧化酶提供了基礎(chǔ)。

[1] 孫兵兵,王筱蘭,楊志平.D—氨基酸氧化酶的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程,2007,24(2)：8-11.

[2] 于慧敏,馬現(xiàn)鋒,羅暉,等.D—氨基酸氧化酶與麥芽糖結(jié)合蛋白和透明顫菌血紅蛋白的融合表達(dá) [J].生物工程學(xué)報,2008,24(6)：1004-1009.

[3] 馮美卿,史訓(xùn)龍,孫傳文,等.D—氨基酸氧化酶在畢赤酵母中的表達(dá)及快速純化[J].復(fù)旦學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版),2006,33(5)：622-625.

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[5] Yu H,Ma X,Luo H,et al.Fusion expression of D—amino acid oxidase from Trignoposis variabilis with maltose binding protein and Vitreoscilla hemoglobin[J].Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2008,24(6)：1004-1009.

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