董冉冉 張 燕 時(shí)克林 馬艷芳 李玲君 王曉蕾

(1.山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院,濟(jì)南 250014； 2.淄博六中，淄博 252300)

毛細(xì)管電泳電化學(xué)法檢測(cè)過(guò)氧化氫

董冉冉1張 燕1時(shí)克林2馬艷芳1李玲君1王曉蕾1

(1.山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院,濟(jì)南 250014； 2.淄博六中，淄博 252300)

以金微盤電極和離子液體修飾單壁碳納米管糊微盤電極分別作為毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)器，試驗(yàn)了兩種電極對(duì)過(guò)氧化氫的響應(yīng)情況，將金微盤電極與毛細(xì)管電泳聯(lián)用，對(duì)過(guò)氧化氫進(jìn)行了定性和定量檢測(cè)。探討了分離電壓、緩沖溶液pH值和工作電位等條件對(duì)H2O2檢測(cè)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，峰電流與H2O2濃度在1.0×10-6～1.0×10-5mol/L和3.0×10-5～1.0×10-3mol/L呈良好的線性，線性回歸方程分別為y(nA)=0.041 78+0.015 5x (μmol/L)，y(A)=-3.304 5×10-4+0.024 29x (mmol/L)，相關(guān)系數(shù)分別為0.997 5和0.999 0，當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，濃度檢出限為5×10-7mol/L。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，樣品中的多巴胺、抗壞血酸等對(duì)H2O2的測(cè)定無(wú)干擾。

金微盤電極 碳納米管糊微盤電極 毛細(xì)管電泳 電化學(xué)檢測(cè) 過(guò)氧化氫

自由基是近年來(lái)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在生命活動(dòng)的代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生各種活性氧自由基（ROS）。過(guò)氧化氫（H2O2）作為活性氧家族中的一員也是體內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物，氧化作用很強(qiáng)，可由超氧陰離子自發(fā)岐化生成，并能進(jìn)一步生成羥自由基；可直接作用于膜脂質(zhì)，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷、DNA損傷及其它的生物疾?。?］；還可通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化物分解代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA），促使蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合反應(yīng)引起細(xì)胞損傷［2］。H2O2不僅能直接氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)及蛋白，而且能自由穿過(guò)細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的鐵離子反應(yīng)生成·OH等活性更強(qiáng)的自由基，引起一系列的損傷［3］。由于H2O2在生命體中發(fā)揮著重要的作用，設(shè)計(jì)一種有效、準(zhǔn)確地檢測(cè)H2O2的方法，可以提前診斷和預(yù)防某些氧化脅迫和損傷誘導(dǎo)的重要疾?。?］。

H2O2的檢測(cè)方法主要有電化學(xué)檢測(cè)法［5］、分光光度法［6］、化學(xué)發(fā)光法［7］、熒光法［8］。在這些方法中紫外檢測(cè)法的樣品用量大且檢測(cè)靈敏度不高；熒光法靈敏度雖高但因儀器昂貴而不能得到廣泛推廣；電化學(xué)檢測(cè)法因其靈敏度較高、儀器設(shè)備較廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)而常見(jiàn)報(bào)道［9］。A lpat［10］用石墨粉、礦物油、H2O2酶、沸石混合制成碳糊電極，利用脈沖和循環(huán)伏安法檢測(cè)了 H2O2，H2O2濃度在5×10-6～1×10-3mol/L范圍內(nèi)與循環(huán)伏安信號(hào)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為8×10-7mol/L，該方法成功地用于檢測(cè)牛奶中的H2O2。毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)法因樣品用量小、靈敏度高、選擇性好、分析時(shí)間短、儀器設(shè)備價(jià)格低而被廣泛應(yīng)用。

筆者自制了金微盤電極和離子液體修飾碳納米管糊微盤電極作為毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)器，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較了兩種電極對(duì)H2O2的響應(yīng)情況，選擇了金微盤電極與毛細(xì)管電泳聯(lián)用在正電位區(qū)檢測(cè)H2O2，探討了分離電壓、緩沖溶液pH值和工作電位等條件對(duì)H2O2檢測(cè)的影響，實(shí)現(xiàn)了H2O2的定性和定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電化學(xué)工作站：CHI802b 型，上海辰華儀器公司；

高壓電源：山東師范大學(xué)儀器廠；

毛細(xì)管：?25 μm×35 cm，河北永年瑞灃色譜器件有限公司；

H2O2：30%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

抗壞血酸（AA）：純度99%，美國(guó)Sigma公司；

多巴胺（DA）：純度98%，美國(guó)Sigma公司；

N-辛基吡啶六氟磷酸鹽：上海成捷有限公司；

磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)中所用水均為石英亞沸高純水，所用溶液使用前均用0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾。

1.2 離子液體修飾碳納米管糊微盤電極和金微盤

電極的制備

（1）離子液體修飾碳納米管糊微盤電極的制備

將單壁碳納米管和離子液體以不同的質(zhì)量比混合均勻，加熱后裝入內(nèi)徑200μm、外徑375 μm、長(zhǎng)約4 cm的石英毛細(xì)管中，用一銅絲在加熱的情況下將單壁碳納米管和離子液體壓緊以保持良好導(dǎo)電性，將銅絲另一端纏繞到一直徑0.4 mm，長(zhǎng)5 cm的銅絲上，兩銅絲接觸部分涂上銀導(dǎo)電膠，放在80℃ 烘箱中烘干。將石英毛細(xì)管和銅絲插入一長(zhǎng)約3.0cm、外徑約1 mm、內(nèi)徑約為0.3 mm的玻璃管，用GJ-301型環(huán)氧樹(shù)脂膠將銀導(dǎo)電膠所覆蓋的部分封在玻璃管內(nèi)，將電極晾干，在硫酸紙上打磨光滑待用。

（2）金微盤電極的制備

將一直徑為200μm、長(zhǎng)約4 cm金絲插入一段長(zhǎng)約3 cm、內(nèi)徑250μm、外徑375 μm的石英毛細(xì)管中，一端露出金絲，一端與石英毛細(xì)管末端對(duì)齊，用GJ-301型環(huán)氧樹(shù)脂膠填滿整個(gè)毛細(xì)管，將露在外面的金絲纏繞到一長(zhǎng)約5 cm的銅絲（?0.4 mm×5 cm）上，并用銀導(dǎo)電膠將纏繞部分覆蓋，使其導(dǎo)電良好，將其放在80℃烘箱中烘1 h后，插入一段長(zhǎng)約3.0cm、外徑約1 mm、內(nèi)徑約為0.5 mm的玻璃管，用GJ-301型環(huán)氧樹(shù)脂膠封住玻璃管的兩端，將毛細(xì)管和銅絲接口處封在玻璃管內(nèi)，用金相砂紙打磨使電極表面光滑，依次用二次水、乙醇、二次水各超聲5 min，晾干待用。

1.3 H2O2的分析

毛細(xì)管電泳分離系統(tǒng)建立在自組裝的電泳儀上，毛細(xì)管進(jìn)樣端與高壓電源正極一起插入電泳緩沖液池中。毛細(xì)管出口端用固定在檢測(cè)電解池上，高壓電源負(fù)極與此檢測(cè)池連通。充滿電泳緩沖液的毛細(xì)管與高壓電源形成回路，構(gòu)成毛細(xì)管區(qū)帶電泳的分離系統(tǒng)。工作前，利用三維顯微操縱器調(diào)節(jié)工作電極的位置與毛細(xì)管的出口端緊密對(duì)接。調(diào)節(jié)高壓電源電壓為18 kV，當(dāng)基線電流平穩(wěn)后，電壓調(diào)到5 kV電遷移進(jìn)樣10.0s，并開(kāi)始記錄電泳圖。檢測(cè)系統(tǒng)在CHI802b上利用三電極體系，以柱端安培檢測(cè)法對(duì)H2O2進(jìn)行檢測(cè)。毛細(xì)管在使用前依次用0.1 mol/L NaOH、二次水、電泳緩沖液各清洗5 m in，工作電極電勢(shì)均相對(duì)于飽和甘汞電極（SCE）。

2 結(jié)果與討論

2.1 工作電極的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)［11］報(bào)道的以N-辛基吡啶六氟磷酸鹽為粘合劑的CNTs電極對(duì)H2O2的電化學(xué)反應(yīng)有明顯的催化作用，筆者認(rèn)為該類電極可以用作毛細(xì)管電泳檢測(cè)器。實(shí)驗(yàn)中筆者以不同比例制備了離子液體修飾碳納米管糊微盤電極和金微盤電極，分別試驗(yàn)了單壁碳納米管和離子液體質(zhì)量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、1∶1 時(shí)制成的離子液體修飾單壁碳納米管糊微盤電極和金微盤電極對(duì)H2O2的響應(yīng)情況。圖1為H2O2在單壁碳納米管與離子液體的質(zhì)量比為3∶7的糊微盤電極和金微盤電極上的電泳圖。分離電壓：圖1A為14 kV,圖1B為18 kV；H2O2濃度：圖1A為1 mmol/L，圖1B為0.1 mmol/L；緩沖溶液：0.025 mol/L pH 7.4 PBS；5.0kV電遷移進(jìn)樣10.0s；檢測(cè)電勢(shì)：0.80V；毛細(xì)管：內(nèi)徑25 μm，外徑 375 μm, 長(zhǎng) 35 cm。

圖1 H2O2在離子液體修飾碳納米管糊微盤電極（A）和金微盤電極（B）上的電泳圖

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單壁碳納米管含量越大，基線則越高，噪音也越大，當(dāng)質(zhì)量比為3∶7時(shí)所制得的糊微盤電極信噪比較好，但這種離子液體修飾碳納米管糊微盤電極檢測(cè)H2O2時(shí)基線仍太高、噪音太大，信噪比很小，不適合用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)。因此實(shí)驗(yàn)選擇了金微盤電極作為工作電極。

2.2 檢測(cè)電勢(shì)

在0.025 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，固定進(jìn)樣條件和分離條件，改變檢測(cè)電勢(shì)Ed，對(duì)H2O2進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測(cè)電位在負(fù)電位區(qū)時(shí)，電流基線過(guò)高，且空白液出現(xiàn)峰電流（檢測(cè)條件同圖1），這是由于在負(fù)電位區(qū)時(shí)水中的溶解氧會(huì)在電極表面反應(yīng)所致［5］。當(dāng)檢測(cè)電勢(shì)在正電位區(qū)時(shí)，峰電流隨著檢測(cè)電位的增大而增大，信噪比增大，當(dāng)高于0.9 V后，隨檢測(cè)電勢(shì)增大，基線電流也顯著增大，基線噪音也增大，信噪比明顯減小，所以選擇檢測(cè)電勢(shì)為0.8 V。

2.3 分離電壓

分離電壓對(duì)分離速度、分離度、半峰寬等均產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)在0.025 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，固定進(jìn)樣條件及檢測(cè)條件，在10～20kV電壓范圍內(nèi)選擇不同的分離電壓Vs進(jìn)行H2O2檢測(cè)（實(shí)驗(yàn)條件同圖1）。表1列出了遷移時(shí)間tm、峰半寬W1/2、分離電壓Vs與峰電流ip值。

表1 分離電壓與i p、t m、W1/2的關(guān)系

由表1可以看出，遷移時(shí)間隨分離電壓的增大而減少，峰電流隨分離電壓增大而增大，但是高電壓也同時(shí)造成了基線噪音增大，從而降低了信噪比。因此實(shí)驗(yàn)中選擇18 kV為分離電壓。

2.4 緩沖溶液的pH值

試驗(yàn)了不同pH值的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液對(duì)H2O2測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值在6.8～9.0時(shí)，峰電流隨著pH值的增大而增加，但變化幅度不大。由于H2O2在pH 3.5～4.5時(shí)最穩(wěn)定，在堿性溶液中極易分解，本實(shí)驗(yàn)將用于檢測(cè)生物樣品，因此選擇了緩沖溶液的pH值為7.4。

綜合上述結(jié)果，毛細(xì)管電泳檢測(cè)H2O2的最佳實(shí)驗(yàn)條件：緩沖液為0.025 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4（pH 7.4），分離電壓為18 kV，檢測(cè)電勢(shì)為0.8 V，進(jìn)樣時(shí)間為5 kV下進(jìn)樣10.0s。

2.5 工作曲線、精密度、檢出限

在上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度的H2O2進(jìn)行電泳分離，H2O2濃度在1.0×10-6～1.0×10-5mol/L和 3.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)與峰電流呈較好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為y(nA)=0.041 78+0.015 5x (μmol/L)，y(A)=-3.304 5×10-4+0.024 29x (mmol/L)，相 關(guān) 系 數(shù) 分 別 為 0.997 5，0.999 0。當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，H2O2的檢出限為5×10-7mol/L。對(duì)1×10-4mol/L的H2O2進(jìn)行7次平行測(cè)定，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，tm與ip的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.2%、2.7%，表明這種測(cè)定H2O2的方法具有良好的重現(xiàn)性。

實(shí)驗(yàn)中，對(duì)其它常見(jiàn)的電活性物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示（分離電壓：18 kV,其它檢測(cè)條件同圖1）。

圖2 H2O2、多巴胺、抗壞血酸混合液的電泳譜圖

從圖2中可以看出，抗壞血酸（AA）和多巴胺（DA）在毛細(xì)管電泳譜圖上能夠得到很好的分離，說(shuō)明這些電活性物質(zhì)不會(huì)干擾H2O2的測(cè)定。

2.6 樣品檢測(cè)

酶催化反應(yīng)在生命的新陳代謝過(guò)程中具有重要的作用。酶作為具有高度專一性和高效性的特殊生物源催化劑, 在藥物化學(xué)、食品檢驗(yàn)、分析化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［12］。葡萄糖氧化酶（GOD）是一種需氧脫氫酶，對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)副作用，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，是一種高效高度專一的生物催化劑，葡萄糖氧化酶的每個(gè)酶分子中含有兩單位FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸），在有氧條件下能專一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生H2O2。利用有氧催化葡萄糖生成葡萄糖酸這一性質(zhì)可以有效除氧，例如果汁、啤酒、油脂罐頭中除氧，金屬器械防腐，并且廣泛用于抗氧化劑、葡萄糖酸的生產(chǎn)［13］。

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，向葡萄糖溶液中加入葡萄糖氧化酶，檢測(cè)不同時(shí)間下催化反應(yīng)生成的H2O2的量，每5 m in取樣檢測(cè)一次，得到催化反應(yīng)中電流大小與催化時(shí)間的關(guān)系圖（見(jiàn)圖3，其中葡萄糖：1 mmol/L, GOD：43.6 U/L;其它檢測(cè)條件同圖1)。

圖3 催化反應(yīng)中H2O2的峰電流與催化時(shí)間的關(guān)系

由圖3可見(jiàn)，加入GOD后，立即有H2O2生成，由此說(shuō)明，酶催化反應(yīng)基本沒(méi)有滯后期。在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，電流明顯增大，電流與催化時(shí)間成正比，隨酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)速率逐漸變小，曲線彎曲；當(dāng)催化時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，底物葡萄糖基本耗盡，反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)，不再有H2O2生成，酶催化反應(yīng)達(dá)到平衡，電流達(dá)到穩(wěn)定。

研究了溫度對(duì)酶活性的影響，當(dāng)催化反應(yīng)控制在25℃時(shí)，催化反應(yīng)進(jìn)行25 m in達(dá)到平衡，之后電流沒(méi)有明顯的變化，而當(dāng)催化反應(yīng)控制在40℃時(shí)，催化反應(yīng)只需進(jìn)行15 m in，反應(yīng)很快達(dá)到平衡，并且電流增大的幅度比在25℃時(shí)明顯大，說(shuō)明隨著溫度的升高，葡萄糖氧化酶的活性提高，酶催化反應(yīng)能更快地達(dá)到平衡。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)金微盤電極與離子液體修飾碳納米管糊微盤電極測(cè)定H2O2的響應(yīng)情況的比較，選擇了金微盤電極在正電位區(qū)不用除氧即可實(shí)現(xiàn)過(guò)H2O2的檢測(cè)，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，H2O2的檢出限為5×10-7mol/L。該法可用于葡萄糖氧化酶催化反應(yīng)的研究。

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DETERM INATION OF HYDROGEN PEROXIDE BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS W ITH AMPEROMETRIC DETECTION

Dong Ranran1, Zhang Yan1, Shi Kelin2，Ma Yanfang1, Li Lingjun1, Wang Xiaolei1
(1.College of Chemistry Chemical Engineering and Materials Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China;2.Zibo No.6 High School of Shandong, Zibo 252300, China)

Gold m icroelectrode and ionic liquid modified-SWNTs paste m icroelectrode made by ourselves were used in capillary zone electrophoresis w ith electrochem ical end-column amperometric detection to determ ine hydrogen peroxide. Gold m icroelectrode showed higher sensitivity to H2O2was used as the detector of capillary electrophoresis. Factors influencing the performance, including separation voltage, detection potential and pH value of the buffer were studied. Under optim ized detection conditions, hydrogen peroxide responded linearly from 1.0×10-5-1×10-3mol/L and 3.0×10-5-1.0×10-3w ith a correlation coefficient of 0.997 5 and 0.999 0respectively. The concentration limit of detection of the method was 5×10-7mol/L（S/N=3）. The experiment also showed that there was no electroactive interferences such as dopam ine and ascorbic acid.

gold m icroelectrode, SWNTs paste m icroelectrode, capillary electrophoresis, electrochemical detection,hydrogen peroxide

2011-09-19