劉 光楊瑞鋒石秉煬劉德培

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100005

線粒體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)蛋白原核表達(dá)與純化

劉 光,楊瑞鋒,石秉煬,劉德培

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100005

目的獲取人線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子 B1(TFB1M)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子 B2(TFB2M)基因片段,高效表達(dá)和純化帶有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (GST)標(biāo)簽的 GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。方法

設(shè)計引物擴(kuò)增得到 TFAM、TFB1M、TFB2M的 cDNA片段,通過引入的酶切位點克隆至表達(dá)載體pET42a,構(gòu)建重組表達(dá)載體,并導(dǎo)入E.coliBL21宿主菌中,異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)重組的 GST融合蛋白,谷胱甘肽瓊脂糖珠純化表達(dá)產(chǎn)物,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果獲得 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M表達(dá)質(zhì)粒,測序結(jié)果與 GenBank的基因序列一致。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,重組 GSTTFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白分別在相對分子質(zhì)量56 000、67 000、69 000處出現(xiàn)特異性蛋白條帶,經(jīng) GST親和層析純化后,得到高純度的融合蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建了基因重組體 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M,制備了 GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子A;線粒體轉(zhuǎn)錄因子B1;線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2;融合蛋白;純化

DO I:10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.011

線粒體普遍存在于真核細(xì)胞,是進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化的主要細(xì)胞器,也是調(diào)控細(xì)胞凋亡和產(chǎn)生活性氧的重要部位。線粒體主要是通過氧化磷酸化系統(tǒng)為機(jī)體生命活動提供絕大部分能量,其氧化磷酸化系統(tǒng)則主要由定位于線粒體內(nèi)膜上的 5個復(fù)合物酶類組成,被稱為電子傳遞鏈,這些復(fù)合物的組成亞基由核 DNA和線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)共同編碼,其中mtDNA編碼的13個亞基是線粒體復(fù)合物所必需的,因此mtDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)對于氧化磷酸化適應(yīng)機(jī)體的能量需求非常重要。

mtDNA是閉合的雙鏈環(huán)狀分子,一條為重鏈,一條為輕鏈,人類和小鼠的 mtDNA分別長 16.6和 16.3 kb。mtDNA可編碼 37個基因,包括 2個核糖體 RNA、22個 tRNA和 13個蛋白分子,其中,13個蛋白分子是線粒體氧化磷酸化復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ中的必需亞基[1-2]。重鏈上有兩個轉(zhuǎn)錄啟動子 HSP1和 HSP2[3]:HSP1負(fù)責(zé)兩個核糖體 RNA、tRNAphe和 tRNAval的轉(zhuǎn)錄[4],HSP2負(fù)責(zé)重鏈上的大部分基因轉(zhuǎn)錄。在 HSP和LSP啟動子區(qū),距轉(zhuǎn)錄起始位點 -12 bp～39 bp處有一核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,線粒體中重要的轉(zhuǎn)錄因子線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A (mitochondrial transcription factor A,TFAM)可與這一元件結(jié)合,而后募集線粒體 RNA聚合酶 [polymerase(RNA)mitochondrial,POLRMT]和其他因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,啟動轉(zhuǎn)錄[5-6]。

在酵母中,線粒體 RNA聚合酶與 sc-mtTFB形成異二聚體后被募集在 mtDNA啟動子區(qū),啟動轉(zhuǎn)錄[7]。人線粒體轉(zhuǎn)錄因子B1(mitochondrial transcription factor B1,TFB1M)和人線粒體轉(zhuǎn)錄因子 B2(mitochondrial transcription factor B2,TFB2M)是酵母 sc-mtTFB的同源物,TFB1M和 TFB2M與酵母中sc-mtTFB的功能相似,是線粒體基因的特異性轉(zhuǎn)錄因子,不具有序列識別特異性,需要 TFAM的協(xié)同來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄效應(yīng)[8]。TFB1M和 TFB2M可與 TFAM的C-末端及線粒體 RNA聚合酶相互結(jié)合,激活轉(zhuǎn)錄。體外實驗證明,純化的重組蛋白 POLRMT/TFAM/TFB1M或 POLRMT/TFAM/TFB2M復(fù)合物可結(jié)合到mtDNA的啟動子區(qū),啟始轉(zhuǎn)錄,三者缺一不可。因此,POLRMT、TFAM和 TFB1M/TFB2M被認(rèn)為是線粒體轉(zhuǎn)錄工廠的核心成分[9]。本研究采用 pET42a構(gòu)建了 TFAM、TFB1M和 TFB2M的原核表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌中經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷 (IsoPropylβ-D-Thio-Galactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)后,純化得到融合有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (glutathione S transferase,GST)標(biāo)簽的融合蛋白 GST-TFAM、GST-TFB1M和 GST-TFB2M,以期為研究線粒轉(zhuǎn)錄機(jī)制及鑒定新的參與調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄的蛋白因子提供一種新的研究手段。

材料和方法

標(biāo)本和試劑 人 HeLa細(xì)胞 cDNA由本實驗室制備;感受態(tài) DH5α、BL21(DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司,大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒 pET42a(+)購自美國 Novagen公司;M-MLV Reverse Transcriptase、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase及 Prestained Protein Marker購自美國 New England Biolabs公司,PrimerStar Taq DNA Polymerase、DNA marker(100 bp marker,DL2000,wide range marker)購自日本 TaKaRa公司,谷胱甘肽瓊脂糖珠購自美國 GE公司,質(zhì)粒小提試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技 (北京)有限公司,IPTG購自美國 Sigma公司。

原核表達(dá)載體 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M和 pET42a-TFB2M的構(gòu)建 根據(jù) GenBank登陸的人TFAM、TFB1M和 TFB2M的 cDNA序列設(shè)計以下引物:(1)P1:TFAM-BamHⅠ:CGCggatccG CGTTTCTCCGAAGC;(2)P2:TFAM-XhoⅠ:CCGctcgagA GCGTAATCTGGAACATCG;(3)P3:TFB1M-BamHⅠ:CGCggatccG CTGCCTCCGGAAAACTC;(4)P4:TFB1MXhoⅠ:CCGctcgagA GCGTAATCTGGAACATCG;(5)P5:TFB2M-PstⅠ:AAAActgcagTGGATCCCAGTGGTCG;(6)P6:TFB2M-HindⅢ:CCCaagcttA GCGTAATCTGGAA-CATCG。P1及 P2的擴(kuò)增片斷經(jīng)BamHⅠ及XhoⅠ酶切后連入 pET42a(+)中構(gòu)建了 pET42a(+)-TFAM原核表達(dá)質(zhì)粒;P3和 P4擴(kuò)增片斷經(jīng)BamHⅠ及XhoⅠ酶切后連入 pET42a(+)中構(gòu)建了pET42a-TFB1M原核表達(dá)質(zhì)粒;P5和 P6擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PstⅠ及HindⅢ酶切后連入 pET42a(+),構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒 pET42a-TFB2M。先經(jīng)酶切鑒定正確后,送英駿公司用 pET42a(+)上的通用引物 S·Tag primer和 T7 trminator primer進(jìn)行測序,測序正確的質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。

pET42a和 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M和pET42a-TFB2M在大腸桿菌中的表達(dá) 將質(zhì)粒 pET42a和 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M和 pET42a-TFB2M轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)細(xì)菌中,37℃培養(yǎng)至 OD600=0.6;加入終濃度為 0.2 mmol/L的 IPTG,30℃誘導(dǎo)4 h;收集菌后用含 PMSF的溶液 (20 mmol/L Tris-HCl,pH7.2,300 mmol/L NaCl)重懸,超聲破碎細(xì)胞;12 000 r/min(r=84 mm)離心 20 min后取 2μl上清,加水稀釋到 20μl,再加入 5μl 5×上樣buffer,經(jīng) PAGE電泳后用于考馬斯亮藍(lán)染色。

GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M 和pET-42a-HA表達(dá)蛋白的純化 將 50μl谷胱甘肽瓊脂糖珠加入 1 ml超聲后的 pET-42a、pET-42a-TFAM、pET42a-TFB1M和 pET42a-TFB2M上清中,4℃搖 3～4 h,2500 r/min(r=134 mm)離心 5 min,棄去上清;用冷 PBS洗 6遍,每次 4℃搖 10 min,2500 r/min(r=134 mm)離心 5 min,棄上清。最后一次棄上清后,加 50μl洗脫液,4℃搖 10 min,2500 r/min(r=134 mm)離心 5 min,將上清轉(zhuǎn)移到新的 EP管中;此步驟重復(fù) 1次;將兩次的上清收集在一起,取 2μl上清,SDS-PAGE電泳后,用考馬斯亮藍(lán)染色。

W estern blot檢測 將上述純化后的融合蛋白GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M測定濃度后取5μl進(jìn)行 SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h,然后用 TBST洗膜 3次,每次 10 min。用 anti-GST抗體識別融合蛋白,4℃孵育過夜;TBST洗膜,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育 1 h,TBST洗膜后以 ECL發(fā)光試劑盒顯影并曝光。

結(jié) 果

原核表達(dá)質(zhì)粒 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M的酶切鑒定 將擴(kuò)增的 TFAM(729 bp)和 TFB1M(1071 bp)的 PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后,連入BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的 pET42a質(zhì)粒中構(gòu)建 pET42a-TFAM和 pET42a-TFB1M原核表達(dá)質(zhì)粒;將擴(kuò)增的 TFB2M(1215 bp)的 PCR產(chǎn)物用PstⅠ和HindⅢ雙酶切后,連入PstⅠ和HindⅢ雙酶切的 pET42a質(zhì)粒中構(gòu)建 pET42a-TFB2M原核表達(dá)質(zhì)粒,連接前的片段如圖 1所示。采用上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)菌,卡那霉素抗性LB平板篩選,每種連接產(chǎn)物從長出的克隆中各挑 3個克隆進(jìn)行小量質(zhì)粒提取,然后分別用相應(yīng)的雙酶切進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,其中,pET42a-TFAM的 3個質(zhì)粒全部酶切正確,pET42a-TFB1M有兩個質(zhì)粒PB1-1、PB1-2酶切鑒定正確,pET42a-TFB2M有 1個質(zhì)粒 PB2-1酶切鑒定正確 (圖 2)。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行 DNA測序分析,結(jié)果證實擴(kuò)增的目的基因片段與 GenBank上公布的基因序列完全一致。

原核表達(dá)質(zhì)粒 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M和 pET42a-TFB2M的小量誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒各選 1個亞克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL2l(DE3),結(jié)果顯示在用 IPIG誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)樣中表達(dá)量差異明顯 (圖 3),所表達(dá)的融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式存在。

圖 1 構(gòu)建質(zhì)粒連接前片段Fig 1 Digestion of the PCR products and vectors by restriction enzyme

圖 2 質(zhì)粒 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M和 pET42a-TFB2M的酶切鑒定圖譜Fig 2 Identification of pET42a-TFAM,pET42a-TFB1M,and pET42a-TFB2M by restriction enzyme digestion

圖 3 原核表達(dá)質(zhì)粒 pET42a、pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M和 pET42a-TFB2M的小量誘導(dǎo)表達(dá)Fig 3 Small induced expressions of pET42a,pET42a-TFAM,pET42a-TFB1M,and pET42a-TFB2M

融合蛋白 GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB1M的表達(dá)及純化鑒定 SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示,純化的 GST、GST-TFAM、GST-TFB1M和 GST-TFB2M融合蛋白均出現(xiàn)特異性條帶 (圖 4)。Western blot證實純化的融合蛋白能與抗 GST的抗體特異性結(jié)合,得到 GST-TFAM,GST-TFB1M的量在 80%以上,GST-TFB2M也有 50%的特異條帶 (圖 5)。

圖 4 純化后的 GST、GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白Fig 4 Purified GST,GST-TFAM,GST-TFB1M and GSTTFB2M fused protein

圖 5 Western blot鑒定重組人 GST-TFAM、GST-TFB1M和GST-TFB2M融合蛋白Fig 5 Identification of recombinant GST-TFAM,GST-TFB1M,and GST-TFB2M fusion protein byWestern blot analysis

討 論

在正常的生理條件下,機(jī)體對能量需求隨時都在改變,這就需要線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)的產(chǎn)能迅速而靈敏的變化,以應(yīng)答機(jī)體隨時變化的能量需求。當(dāng)線粒體功能障礙,特別是氧化磷酸化缺陷時,可導(dǎo)致一系列臨床表現(xiàn)多樣性的疾病,即線粒體疾病,如:遺傳性線粒體疾病、衰老及相關(guān)病變[10-11]。氧化磷酸化是機(jī)體的精細(xì)調(diào)節(jié)系統(tǒng),隨機(jī)體能量需求的改變而呈動態(tài)變化,對核基因編碼及mtDNA編碼的線粒體蛋白調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的體系,目前對核基因編碼的線粒體蛋白的調(diào)節(jié)已有很多研究,主要集中在對代謝敏感因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子 1α的研究方面[12-13]。但是,核基因編碼的蛋白激活需要一定過程,其作為線粒體氧化磷酸化調(diào)節(jié)的主要轉(zhuǎn)錄因子還不能很好滿足機(jī)體時刻不同的能量需求。相比而言,mtDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)對于氧化磷酸化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)更為直接,Park等[14]和 Taylor等[15]的研究顯示,mtDNA的轉(zhuǎn)錄終止因子Mterf3可作為mtDNA的負(fù)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化,以應(yīng)對機(jī)體的能量需求。Correia等[16]研究發(fā)現(xiàn),彌漫性浸潤性星形細(xì)胞瘤患者腦組織中的mtDNA拷貝數(shù)明顯下降,并且與 TFAM、TFB1M、TFB2M有一定關(guān)系。這些研究內(nèi)容提示在mtDNA轉(zhuǎn)錄過程中還存在著一些未知的因子和機(jī)制。研究線粒體轉(zhuǎn)錄機(jī)制及鑒定新的參與調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄的蛋白因子,為進(jìn)一步認(rèn)識線粒體相關(guān)疾病的發(fā)病原因提供了新的知識和治療方法。

pET系統(tǒng)是在E.coli中用來克隆和表達(dá)重組蛋白的最有力系統(tǒng)。靶基因被克隆到 pET質(zhì)粒后,置于強(qiáng)的噬菌體 T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號的控制下,宿主菌提供了 T7 RNA聚合酶的來源來誘導(dǎo)表達(dá);T7 RNA聚合酶在完全誘導(dǎo)的情況下,幾乎所有細(xì)胞資源都轉(zhuǎn)到靶基因表達(dá),誘導(dǎo)數(shù)小時后,50%以上的總細(xì)胞蛋白是目的產(chǎn)物。此外,該系統(tǒng)還可以簡單地通過降低誘導(dǎo)物濃度來減少表達(dá)水平,而表達(dá)水平降低可提高某些靶蛋白的可溶性。該系統(tǒng)另一個重要優(yōu)點是在未誘導(dǎo)狀態(tài)下維持靶基因轉(zhuǎn)錄沉默。構(gòu)建的質(zhì)粒克隆到不包含 T7 RNA聚合酶基因的宿主菌后,可以去除蛋白產(chǎn)物對宿主菌的潛在毒性,適合質(zhì)粒的大量制備。本研究選用的 pET42a在 5'端包含有GST·Tag,3'端包含有 His.Tag,加入 IPTG后可以在胞內(nèi)誘導(dǎo)蛋白高效表達(dá),而 GST與目的蛋白的融合能大大增加蛋白的可溶性,可以方便地通過Western blot進(jìn)行檢測,且含有 GST·Tag序列的融合蛋白可以用相應(yīng)的樹脂和緩沖液試劑盒進(jìn)行親和層析純化。另外,pET42a質(zhì)粒在 GST·Tag與融合蛋之間存在著編碼因子 Xa和凝血酶斷裂位點的序列,可以從掛柱的融合蛋白中切下目的蛋白或多肽。本研究采用 pET42a構(gòu)建了 pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M和 pET42a-TFB2M,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和通用引物測序證實其克隆位點和序列的正確性;并在轉(zhuǎn)化菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá),通過 GST·BindTMResin親和層析得到 GST-TFAM、GST-TFB1M和 GST-TFB2M融合蛋白,Western blot檢測驗證其表達(dá)蛋白的正確性及穩(wěn)定性;為此后驗證新的線粒體轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白提供了幫助,并為研究線粒體的轉(zhuǎn)錄機(jī)制及鑒定新的參與調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄的蛋白因子提供了一種新的研究手段。

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Prokayotic Expression and Purification ofM itochondrial Transcription Complex Proteins

L I U Guang,YANG Rui-feng,SH IBing-yang,L I U De-pei

NationalLaboratory ofMedicalMolecularBiology,Institute ofBasic Medical Sciences,CAMS and PUMC,Beijing 100005,China

L IU De-pei Tel:010-65296415,Fax:010-65105093,E-mail:liudp@pumc.edu.cn

ObjectiveTo obtain human mitochondrial transcription factorA(TFAM),mitochondrial transcription factor B1(TFB1M),and mitochondrial transcription factor B2(TFB2M)that were expressed efficiently inE.coliBE21 and to purify the target proteins.M ethods TFAM,TFB1M,and TFB2M segmentswere designed and synthesized.After having been sequenced,the reconstructed expression vectors were constructed by enzyme digestion and by cloning into an expression vector pET42a.Then the reconstructed vectorswere transformed intoE.coliBL21.Recombinant glutathione S transferase(GST)fusion proteins were expressed via the induction of IsoPropylβ-D-ThioGalactoside(IPTG)and purified by glutathione Sepharose 4B.ResultsThe expression plasmids of pET42a-TFAM,pET42a-TFB1M,and pET42a-TFB1M were successfully constructed.The sequences of the cloned gene segmentswere identicalwith GenBank reported. The protein bandswith relative molecularmasses of 56 000,67 000,and 69 000 appeared on sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)after the expressed GST-TFAM,GSTTFB1M,and GST-TFB2M fusion proteins were separated by SDS-PAGE. The expressed fusion proteins were purified to high purity.ConclusionThe recombinant plasmids pET42a-TFAM,pET42a-TFB1M,and pET42a-TFB2M were successfully costructed,and the GST-fused target proteins were prepared.

mitochondrial transcription factor A;mitochondrial transcription factor B1;mitochondrial transcription factor B2;fusion protein;purification

Acta Acad M ed Sin,2011,33(6):638-643

劉德培 電話:010-65296415,傳真:010-65105093,電子郵件:liudp@pumc.edu.cn

Q782

A

1000-503X(2011)06-0638-06

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目 (973計劃) (2011CB503902)和國家重點實驗室專項經(jīng)費(fèi) (2060204)Supported by the National Basic Research Program of China(973 Program)(2011CB503902)and the NationalLaboratory ofMedicalMolecularBiology(2060204)

2011-09-05)

·論 著·