黃澤彬張澤延張曉東繆時(shí)英王琳芳杜潤蕾

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100005 2武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)系,武漢 430072

非洲爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白 2靶蛋白 C'末端 SBP-3×Flag標(biāo)記的 HCT 116結(jié)直腸癌細(xì)胞模型的建立

黃澤彬1,張澤延2,張曉東2,繆時(shí)英1,王琳芳1,杜潤蕾2

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 1000052武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)系,武漢 430072

目的建立非洲爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白 2靶蛋白 (TPX2)C'末端 SBP-3×Flag標(biāo)記的 HCT 116結(jié)直腸癌細(xì)胞模型。方法PCR擴(kuò)增同源臂,構(gòu)建 TPX2的腺相關(guān)病毒打靶載體,包裝病毒后打靶 HCT 116結(jié)直腸癌細(xì)胞,G418和PCR篩選獲得含有新霉素抗性基因的陽性細(xì)胞株,最后通過 Cre病毒感染去除抗性基因,并用 PCR方法篩選獲得 TPX2 C'末端 SBP和 3×Flag內(nèi)源性雙標(biāo)簽的 HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞株。結(jié)果篩選獲得 2個(gè)含有新霉素抗性基因的細(xì)胞株,隨后經(jīng) Cre病毒感染得到去除新霉素抗性基因的陽性細(xì)胞克隆,并經(jīng)Western blot檢測(cè)驗(yàn)證了 SBP-3×Flag基因的敲入。結(jié)論成功建立了 TPX2 C'末端 SBP-3×Flag標(biāo)記的 HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞模型。

非洲爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白 2靶蛋白;基因敲入;同源重組;HCT116;結(jié)直腸癌

DO I:10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.008

結(jié)直腸癌是近年來發(fā)病率和死亡率上升最快的腫瘤之一[1],與其他腫瘤一樣,是一種多基因參與的漸進(jìn)積累轉(zhuǎn)化性疾病,其發(fā)生、發(fā)展以及組織學(xué)分型均與其相關(guān)的癌基因、抑癌基因和一些生長(zhǎng)因子及其遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象有關(guān)[2]。從分子水平探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制,研究相關(guān)基因作用途徑和尋找理想的分子靶標(biāo)對(duì)其早期診斷、治療和預(yù)后以及探索其基因治療和進(jìn)一步提高防治水平都具有重要意義。

非洲爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白 2靶蛋白 (targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2,TPX2)定位于人類染色體 20q11.2,是一個(gè)受細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控的核增殖蛋白,在細(xì)胞有絲分裂紡錘體形成過程中起重要作用[3]。TPX2與腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān),可在多種腫瘤中高表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞中心體擴(kuò)增、異倍體形成、基因組不穩(wěn)定以及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[4-5]。TPX2在結(jié)直腸癌中也高表達(dá)[6],但其在腸癌發(fā)生過程中的功能尚不清楚。為了揭示 TPX2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用,本研究采用基因打靶技術(shù),建立 TPX2 C'末端 SBP-3×Flag標(biāo)記的 HCT 116結(jié)直腸癌細(xì)胞系,作為結(jié)直腸癌研究的模型。

材料和方法

材料 rAAV-pTK-Neo-LoxP-USER-SBP-3×Flag KI載體和 293T、HCT 116細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存,限制性內(nèi)切酶、USER酶和高保真 pfu DNA聚合酶購自美國 NEB公司,質(zhì)粒小提試劑盒購自德國 Qiagen公司,玻璃奶回收試劑盒購自博大泰克,DMEM和 IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國 Hyclone公司,Fugene轉(zhuǎn)染試劑購自瑞士 Roche公司,抗生素新霉素 (G418)購自美國 Gibco公司,Flag抗體購自美國 Sigma公司,山羊抗小鼠 IgG購自中杉金橋。

載體構(gòu)建 根據(jù) rAAV-pTK-Neo-LoxP-USER-SBP-3×Flag KI載體序列和 TPX2基因組序列設(shè)計(jì)引物,以人基因組為模板通過 PCR方法分別擴(kuò)增 5'同源臂和 3'同源臂 (又稱左右臂),純化后使用 USER酶連接至 rAAV-pTK-Neo-LoxP-USER-SBP-3×Flag KI載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α[7],隨后通過菌落 PCR篩選陽性克隆,測(cè)序分析確認(rèn)正確后提取質(zhì)粒。設(shè)計(jì)的引物包括 TPX2同源臂引物 2對(duì) (左右臂各 1對(duì)),新霉素測(cè)序引物、篩選引物和 Cre引物各 1對(duì),如下:(1)左臂引物:上游:5'-GGGAAAGUCATAGGAAGGTTCCACGGACACA-3';下游:5'-GGAGACAUGCGCAGTGGAATCGAGTGGAGAA-3'。(2)右臂引物:上游:5'-GGTCCCAUACTCAGCTGTGAGCTGCGGATA-3';下游:5'-GGCATAGUGTGGTTACTGAGAGAGAGTTAACAGA-3'。(3)新霉素測(cè)序引物:上游:5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3';下游:5'-GGGGTTTGCTCGACATTG-3'。(4)篩選引物:上游:5'-GCTATTGGCAGCTATTGGCATAGG-3';下游:5'-GGGAAGAAGGTACAGTCTGTGTGA-3'。 (5)Cre引物:上游:5'-CCCAAATTCTCCACTCGATTCCA-3';下游:5'-TGGGTTCTCTCCATGCCCAATGA-3'。

病毒包裝及收獲 轉(zhuǎn)染前 1 d將 293T細(xì)胞傳至 6孔板中培養(yǎng),密度控制在 40%～80%;14～16 h內(nèi)將 9μg質(zhì)粒 DNA(pAAV打靶質(zhì)粒、pAAV-RC和pAAV-Helper各 3μg)與 18μl Fugene轉(zhuǎn)染試劑按照說明書混合孵育后加至 293T細(xì)胞中,輕輕搖勻后置于 37℃孵箱;72 h后收集病毒,并于 -80℃保存。

基因打靶 HCT 116細(xì)胞及篩選 將 HCT 116細(xì)胞傳至 24孔板中培養(yǎng),密度控制在 60%～80%,貼壁后加入 100～150μl病毒,輕輕搖勻后置于 37℃孵箱,48 h后用胰酶消化細(xì)胞,并改用含有 0.5 mg/ml新霉素的培養(yǎng)基將細(xì)胞按梯度 (倍比稀釋)分至 4個(gè) 96孔板,置于 37℃孵箱培養(yǎng) 10～14 d后,于顯微鏡下挑取 96個(gè)單克隆,消化后轉(zhuǎn)移到 1個(gè)新的 96孔板,置于 37℃孵箱培養(yǎng)約 2～3 d后消化細(xì)胞,取少量細(xì)胞提取基因組 DNA作為模板,通過 PCR方法篩選成功打靶的陽性克隆并轉(zhuǎn)至 24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

Cre病毒感染去除抗性標(biāo)記及篩選 在以上陽性克隆中挑選 2株?duì)顟B(tài)最好的,各加入 10μl Cre病毒并繼續(xù)培養(yǎng),其余的陽性克隆加凍存液置 -80℃保存。細(xì)胞培養(yǎng) 24 h后用胰酶消化,各取 600～1200個(gè)細(xì)胞按梯度 (倍比稀釋)分到 3個(gè) 96孔板中,37℃孵育 10 d后,于顯微鏡下各挑取 12個(gè)單克隆,2株即共 24個(gè)。消化后轉(zhuǎn)移到 1個(gè)新的 96孔板,置于 37℃孵箱培養(yǎng)約 2～3 d后消化細(xì)胞,取少量細(xì)胞提取基因組DNA作為模板,通過 PCR方法篩選成功去除抗性標(biāo)記的陽性克隆并轉(zhuǎn)至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度約為 50%時(shí),各挑取其中 3個(gè)陽性克隆,2株即共 6個(gè),用胰酶消化后,把每個(gè)克隆分為 2份至6孔板中,其中一份于貼壁后改用含有 0.5 mg/ml新霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),另一份仍用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照,其余的陽性克隆加凍存液置 -80℃保存。10 d后,若用含新霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞死亡,則表明確實(shí)去除了新霉素抗性標(biāo)記,獲得陽性克隆。將正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的陽性克隆各取 1個(gè),2株即共 2個(gè),用胰酶消化后,取一半擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存,另一半仍于 6孔板中培養(yǎng),待長(zhǎng)滿后提取蛋白質(zhì)驗(yàn)證 TPX2-SBP-3×Flag融合蛋白的表達(dá),也即驗(yàn)證 TPX2 C'末端 SBP-3×Flag基因的敲入,其余的陽性克隆加凍存液置 -80℃保存。

W estern blot驗(yàn)證 收集上述 6孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞并提取蛋白質(zhì),10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)后,轉(zhuǎn)印至 PVDF膜,以 TBST(TBS緩沖液 +1%Tween-20)配制的 5%脫脂牛奶室溫封閉 1 h,1∶3000稀釋的Flag和β-actin抗體 4℃下反應(yīng)過夜,TBST洗膜后以1∶10000稀釋的山羊抗小鼠 IgG室溫反應(yīng) 1 h,再次TBST洗膜后以化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

結(jié) 果

載體構(gòu)建 通過 PCR方法擴(kuò)增出左右臂,連接至 rAAV-pTK-Neo-LoxP-USER-SBP-3×Flag KI載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,隨后以菌落 PCR篩選出陽性克隆,并測(cè)序分析確認(rèn)載體構(gòu)建成功。

基因打靶 HCT 116細(xì)胞及篩選 包裝的病毒打靶 HCT116細(xì)胞后挑取 96個(gè)單克隆,分別取少量細(xì)胞提取基因組DNA作為模板,以新霉素測(cè)序上游引物和篩選下游引物配對(duì)進(jìn)行 PCR篩選,共篩選到 2個(gè)擴(kuò)增條帶正確的打靶陽性克隆 (圖 1)。

Cre病毒感染去除抗性標(biāo)記及篩選 將 2株陽性克隆傳至 24孔板,經(jīng) Cre病毒感染后各挑取 12個(gè)單克隆,取少量細(xì)胞提取基因組 DNA作為模板,以Cre引物進(jìn)行 PCR篩選,結(jié)果分別篩選到 7個(gè)和 10個(gè)去除新霉素抗性標(biāo)記的陽性克隆 (圖 2)。各挑取3個(gè)陽性克隆,進(jìn)一步用新霉素篩選,10 d后細(xì)胞全部死亡。

圖 1 PCR擴(kuò)增篩選打靶陽性細(xì)胞克隆Fig 1 Screening for targeting positive cell clones by PCR amplification

圖 2 PCR擴(kuò)增篩選去除新霉素抗性標(biāo)記的陽性細(xì)胞克隆Fig 2 Screening for positive cell clones with neomycin resistance marker being excised by PCR amplification

W estern blot驗(yàn)證 收集細(xì)胞并提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot驗(yàn)證,用 Flag抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,2株細(xì)胞均可在相對(duì)分子質(zhì)量 95 900附近檢測(cè)到 TPX2-SBP-3×Flag融合蛋白的表達(dá) (圖 3)。

圖 3 Western blot驗(yàn)證打靶陽性細(xì)胞克隆Fig 3 Verification of targeting positive cell clones byWestern blot analysis

討 論

基因打靶是 20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù),是利用同源重組將外源基因定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞基因組上某一確定位點(diǎn),精細(xì)地定點(diǎn)修飾和改造目的基因 DNA片段,從而改變細(xì)胞遺傳特性的技術(shù)[8]。該技術(shù)是研究基因結(jié)構(gòu)功能最為有效而直接的方法之一,小鼠胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù)的發(fā)展和基因打靶小鼠模型的建立,充分體現(xiàn)了該技術(shù)在基因結(jié)構(gòu)功能研究中的價(jià)值。隨著該技術(shù)的不斷完善,在胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù)的基礎(chǔ)上逐步建立了體細(xì)胞基因打靶技術(shù)[9]。與胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù)相比,體細(xì)胞基因打靶技術(shù)具有更為簡(jiǎn)便、周期更短、費(fèi)用更低等多方面的優(yōu)勢(shì)。

本研究采用 Zhang等[10]報(bào)道的體細(xì)胞基因打靶技術(shù),建立 TPX2 C'末端 SBP和 3×Flag內(nèi)源性雙標(biāo)簽的 HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞株。建立過程中,打靶效率高達(dá) 2.1%。Cre病毒感染后隨機(jī)挑取 24個(gè)單克隆進(jìn)行 PCR篩選,篩選到 17個(gè)去除新霉素抗性標(biāo)記的陽性克隆,陽性率高達(dá) 70.8%。最后,通過Western blot技術(shù)在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了建立的細(xì)胞株可在相對(duì)分子質(zhì)量 95 900附近檢測(cè)到 TPX2-SBP-3×Flag融合蛋白的表達(dá),表明成功建立了 TPX2 C'末端 SBP和3×Flag內(nèi)源性雙標(biāo)簽的 HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞株。

利用基因打靶技術(shù)進(jìn)行基因功能及在傳導(dǎo)通路中調(diào)控作用的研究是現(xiàn)代分子遺傳學(xué)中先進(jìn)的研究手段。通過基因打靶技術(shù)表位標(biāo)記內(nèi)源蛋白,很好地解決了蛋白功能研究中無抗體或抗體質(zhì)量不好的問題[10]。該技術(shù)可以將 Flag等表位標(biāo)簽加在被研究的蛋白所在的基因組終止密碼子上游,從而在生理表達(dá)水平表達(dá)帶有 Flag等標(biāo)簽的目的蛋白,使 Flag抗體可以代替目的蛋白的抗體進(jìn)行一系列的研究,許多基因/蛋白質(zhì)功能研究方法變得更為簡(jiǎn)便,包括蛋白雜交、免疫沉淀、免疫熒光、染色質(zhì)免疫沉淀微陣列、串聯(lián)親和純化和質(zhì)譜等。同時(shí),Flag標(biāo)簽為通用標(biāo)簽,因此可使檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化。此外,該技術(shù)保證了所研究的蛋白仍處于正常生理狀態(tài),能夠真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的生理性相互作用模式,這是傳統(tǒng)的過表達(dá)等研究方法沒法做到的,因此在做串聯(lián)親和純化結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)時(shí)能保證較低的假陽性率。

構(gòu)建基因打靶載體是關(guān)乎打靶成功與否的重要環(huán)節(jié)之一。由于DNA間發(fā)生同源重組的頻率是很低的,因而打靶載體的選擇和設(shè)計(jì),同源臂長(zhǎng)度的選擇等方面都將直接影響基因打靶的效果。為成功建立打靶細(xì)胞系,本研究注意了以下幾個(gè)方面的問題:(1)打靶載體的選擇。人類基因組復(fù)雜,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法同源重組的效率非常低,而通過腺相關(guān)病毒 (adeno-associated virus,AAV)作為載體介導(dǎo)基因打靶可以大大提高重組效率[11-12],因此本研究選擇了AAV載體。(2)載體同源臂長(zhǎng)度的選擇。載體上外源性同源序列的長(zhǎng)度與同源重組的效率成正相關(guān),同源序列長(zhǎng)度從 4 kb增加到 9 kb,效率提高 40倍。通過腺病毒或質(zhì)粒等傳統(tǒng)的打靶載體與染色體靶位點(diǎn)進(jìn)行有效的同源重組時(shí),長(zhǎng)度一般為 5～10 kb。盡管增加同源臂的長(zhǎng)度能夠提高重組效率,但同時(shí)也明顯提高了同源臂 PCR擴(kuò)增、克隆構(gòu)建和打靶載體轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞的難度。然而AAV載體介導(dǎo)的打靶對(duì)同源臂長(zhǎng)度的要求明顯要低很多,同源臂的長(zhǎng)度在1 kb以內(nèi)就能進(jìn)行有效的打靶,但同源臂長(zhǎng)度的增加有助于提高重組效率[13]。因此本研究選擇了適當(dāng)?shù)耐幢坶L(zhǎng)度,左臂為 919 bp,右臂為 1191 bp。既保證了較高的打靶效率,又有利于同源臂的 PCR擴(kuò)增、克隆和可以運(yùn)用 PCR技術(shù)篩選同源重組的細(xì)胞克隆,有效地提高了效率。(3)DNA聚合酶的選擇。為避免 PCR擴(kuò)增同源臂過程中堿基發(fā)生突變,本研究采用了高保真的 pfu DNA聚合酶。此外,通過對(duì)重組片段的測(cè)序分析保證了載體插入同源臂的正確性。(4)克隆方法的選擇。傳統(tǒng)構(gòu)建基因打靶載體方法依靠限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA連接酶,打靶位點(diǎn)的選擇受到限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的限制,因此通常不能直接操作感興趣的區(qū)域。為此本研究采用了 USER酶進(jìn)行連接的方法來構(gòu)建基因打靶載體,該方法不依賴限制性內(nèi)切酶,可以對(duì)基因組任意位置進(jìn)行改造,很好地解決了以上困難。同時(shí),大大簡(jiǎn)化了載體構(gòu)建步驟,而且效率很高,可高通量構(gòu)建體細(xì)胞基因打靶載體。

綜上,通過體細(xì)胞基因打靶技術(shù),本研究成功建立了 TPX2 C'末端 SBP-3×Flag標(biāo)記的 HCT 116結(jié)直腸癌細(xì)胞模型,為研究 TPX2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。該技術(shù)有著很多的優(yōu)點(diǎn),相信隨著其不斷發(fā)展成熟,一定能發(fā)掘出更多的優(yōu)點(diǎn),從而促進(jìn)該技術(shù)在基因功能研究甚至其他研究中更廣泛的應(yīng)用。

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Establishment of A Targeting Protein for Xenopus Kinesin-like Protein 2 C'Term inal SBP-3×Flag Tagged HCT 116 Colorectal Cancer CellM odel

HUANG Ze-bin1,ZHANG Ze-yan2,ZHANG Xiao-dong2,M I AO Shi-ying1,WANG Lin-fang1,DU Run-lei2

1NationalLaboratory ofMedicalMolecularBiology,Institute ofBasic Medical Sciences,CAMS and PUMC,Beijing 100005,China2Department of Cellular and DevelopmentalBiology,College ofLife Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072,China

DU Run-lei Tel:027-68756606,E-mail:runleidu@whu.edu.cn

ObjectiveTo develop a targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2(TPX2)C'terminal SBP-3×Flag-tagged HCT116 cellmodel.M ethods Homologous armswere amplified by polymerase chain reaction(PCR),and then the adeno-associated virus(AAV)-targeting vector of TPX2 was constructed.HCT 116 cells were targeted after the viruseswere packaged.Positive cell clones with neomycin resistance gene were obtained by G418 and PCR screening.Finally,the neomycin gene cassette was excised after the targeted clones were infected with adenovirus expressing Cre-recombinase,and the TPX2 C'terminal SBP and 3×Flag endogenous double-tagged HCT116 cells were obtained by PCR screening.ResultsTwo positive cell clones with neomycinresistance gene were obtained by PCR screening.The positive cloneswith neomycin resistance gene excised were obtained by Cre adenovirus infection,and the knock-in of SBP-3×Flag gene was verified byWestern blot analysis.ConclusionThe TPX2 C'terminal SBP-3×Flag tagged HCT116 cell modelwas successfully established.

targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2;knock-in;homologous recombination;HCT116;colorectal cancer

Acta Acad M ed Sin,2011,33(6):624-628

杜潤蕾 電話:027-68756606,電子郵件:runleidu@whu.edu.cn

R735.3+4

A

1000-503X(2011)06-0624-05

國家重大研究計(jì)劃項(xiàng)目 (2011CB944302、2011CB944404)、國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)基金 (2060204)和湖北省自然科學(xué)基金(2010CDB08704)Supported by the National Basic Research Program of China(2011CB944302,2011CB944404),the State Key Laboratory Special Fund(2060204),and the Hubei Province Natural Science Foundation(2010CDB08704)

2011-10-18)

·論 著·