劉逸寒，路福平，王建玲，胡 博

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

中溫α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)

劉逸寒，路福平，王建玲，胡 博

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

利用高效表達(dá)載體pWB980，實(shí)現(xiàn)了Bacillus subtilis BF7658中溫α–淀粉酶基因amy在B. subtilis DB403中的高效表達(dá)，活力達(dá)到770,U/mL.經(jīng)多步純化，重組酶AMY的比活達(dá)到35.8,U/mg，純化倍數(shù)為1.7，獲得凝膠電泳條帶單一的蛋白樣品，經(jīng) SDS-PAGE檢測，重組酶 AMY相對分子質(zhì)量為 4.8×104.對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，重組酶 AMY的最適反應(yīng)溫度為60,℃，最適反應(yīng)pH為6.0.

枯草芽孢桿菌；中溫α–淀粉酶；高效表達(dá)；純化；酶學(xué)性質(zhì)

中溫α–淀粉酶的最適作用溫度和 pH分別為60,℃和 6.0，是工業(yè)中應(yīng)用最普遍的酶種之一，被廣泛應(yīng)用于淀粉糖、味精、啤酒、酒精以及紡織退漿等工業(yè)生產(chǎn)[1].1965年，我國開始應(yīng)用B. subtilis BF7658生產(chǎn)α–淀粉酶，發(fā)酵活力為 200,U/mL左右[2].我國于 20世紀(jì) 90年代后期引進(jìn)了國外生產(chǎn)中溫α–淀粉酶的優(yōu)良菌株B. amyloliquefaciens和工藝技術(shù)，發(fā)酵活力平均在 400,U/mL左右.目前我國多數(shù)廠家仍采用 B. subtilis BF7658及其變異株生產(chǎn)中溫α–淀粉酶，產(chǎn)酶水平穩(wěn)定在 550,U/mL左右.但與其他酶制劑品種相比較，其發(fā)酵水平提高較慢，限制了中溫α–淀粉酶在各行業(yè)中的應(yīng)用.

目前，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)已成為繼大腸桿菌之后重要的原核表達(dá)系統(tǒng).枯草芽孢桿菌遺傳背景清楚[3]，蛋白分泌機(jī)制健全，生長迅速，培養(yǎng)簡便，不分泌內(nèi)毒素，具有較好的生物安全性，是美國食品藥物管理局(FDA)和中國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的安全菌株；并且它可直接將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，產(chǎn)物便于提取和純化，是表達(dá)外源基因的良好受體菌.但由于枯草芽孢桿菌自身可向胞外分泌高濃度的蛋白酶，以致影響了表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量和穩(wěn)定性.

本研究將獲得的B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶基因，利用表達(dá)載體pWB980[4]和宿主菌株B. subtilis DB403[5]，對中溫α–淀粉酶進(jìn)行表達(dá).表達(dá)載體pWB980具有高拷貝數(shù)(121個(gè)/細(xì)胞)且含有可高效表達(dá)外源基因的 P43啟動子以及可將外源蛋白分泌到細(xì)胞外的信號肽 sacB基因；同時(shí)，B. subtilis DB403為 3個(gè)蛋白酶缺陷菌株，可減少胞外蛋白酶的分泌量，以期獲得中溫α–淀粉酶的高效表達(dá)，為以淀粉為原料深加工工業(yè)的發(fā)展提供有力的支撐.

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基

B. subtilisBF7658和B. subtilisDB403，均為本實(shí)驗(yàn)室保存.質(zhì)粒 pWB980由加拿大 Calgary大學(xué)Dr. Sui-Lam Wong惠贈.

LB培養(yǎng)基用于細(xì)菌培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)基為含卡那霉素 30,μg/mL的 LB/瓊脂培養(yǎng)基，酶活力初步檢測培養(yǎng)基為含 1%淀粉的 LB/瓊脂培養(yǎng)基，用作透明圈選擇.枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為 GMI、GMII培養(yǎng)基[6].

1.2 酶與試劑

基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、高保真 TaqDNA 聚合酶，TaKaRa公司；DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、卡那霉素，上海英駿生物技術(shù)有限公司；引物合成及測序由TaKaRa 公司完成.

1.3 重組菌株的構(gòu)建

根據(jù) NCBI網(wǎng)站公布的 B. subtilisα–淀粉酶基因序列，經(jīng)比對后設(shè)計(jì)引物，以B. subtilisBF7658總 DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶基因 amy，上游引物 P1：5′-CCC AAGCTTTTGCGCTTACAGCACCGTCGATCAA-3′(下劃線部分為 HindIII酶切位點(diǎn))，下游引物 P2：5′-CGCGGATCCTTGAAAGAATGTGTTACACCT-3′(下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)).將PCR產(chǎn)物及提取的質(zhì)粒pWB980，分別用HindIII和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4 DNA連接酶于16,℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pWB-amy，參照文獻(xiàn)[7]轉(zhuǎn)化B.subtilisDB403，將含卡那霉素的酶活初步檢測平板上的轉(zhuǎn)化子逐一點(diǎn)接在含卡那霉素的 LB/瓊脂平板上保存，碘液熏蒸檢測平板，確定透明圈與菌落直徑比值大的轉(zhuǎn)化子后，在 LB/瓊脂保存平板上挑取相應(yīng)轉(zhuǎn)化子，分別進(jìn)行 PCR和雙酶切法鑒定并進(jìn)行測序.

1.4 重組酶的表達(dá)

將獲得的工程菌株 pWB-amy/DB403和對照菌株 pWB980/DB403分別接種于 5,mL的含卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37,℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有50,mL含卡那霉素LB培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中，37,℃培養(yǎng) 36,h，12,000,r/min 離心 10,min，收集上清液，SDS-PAGE(分離膠濃度為 10%，濃縮膠濃度為 5%)檢測蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)測定酶活力.采用Lowry法測定蛋白含量[8].

1.5 工程菌株7,L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉 55，豆餅粉 45，淀粉2，硫酸銨 4，磷酸氫二鈉 8，氯化銨 1.3，氯化鈣 2.7，pH自然.

7 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)[9].

1.6 活力檢測

中溫α–淀粉酶活性測定方法和其他溶液的配制參照 QB/T 1803—1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》.酶活計(jì)算：X＝c×n.式中：X為樣品的酶活力，U/mL(U/g)；c為測試酶的濃度，U/mL；n為樣品的稀釋倍數(shù).

1.7 重組酶的分離純化

收集工程菌 pWB-amy/DB403發(fā)酵上清液100,mL，加硫酸銨至 70%，4,℃靜置過夜，6,000,r/min離心20,min，蛋白沉淀用10,mL 0.02,mol/L磷酸緩沖液(pH,7.0)溶解.得到的活性組分上樣到用濃度為0.02,mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)平衡過的 DEAESepharose Fast Flow(2.4,cm×30,cm)離子交換層析柱，用同樣的緩沖液先洗脫未吸附的蛋白，再用含0～1,mol/L,NaCl的 0.02,mol/L磷酸緩沖液(pH,7.0)線性梯度洗脫，收集活性組分.將得到的活性組分上樣到用 0.02,mol/L磷酸緩沖液(pH,7.0)平衡過的Sephadex G-75(1.6,cm×80,cm)凝膠層析柱，再用同樣的緩沖液洗脫，收集活性組分.每步收集到的活性組分進(jìn)行活力檢測，并采用 Lowry法測定蛋白含量[8].

1.8 重組酶學(xué)性質(zhì)分析

1.8.1 溫度對酶活力的影響

純酶最適反應(yīng)溫度的測定：在不同溫度(30、40、50、60、70、80、90、100,℃)、pH 6.0 條件下保溫5,min，測定重組酶純酶液的酶活力，將最高酶活力定為100%.

純酶的熱穩(wěn)定性測定：將重組酶純酶液置于不同溫度(40、60、80、100,℃)、pH,6.0 條件下保溫 1,h，每隔10,min取出，各自測定其殘余酶活力，以未保溫的酶液活力為100%，繪制熱穩(wěn)定性曲線.

1.8.2 pH對酶活力的影響

純酶最適反應(yīng) pH 的測定：在不同 pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、60,℃條件下保溫 5,min，測定重組酶純酶液的酶活力，將最高酶活力定為100%.

純酶的 pH穩(wěn)定性測定：將重組酶純酶液在不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)條件下 60,℃保溫 60,min，各自測定其殘余酶活力，將最高殘余酶活力定為100%，繪制pH穩(wěn)定性曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的篩選與鑒定

以提取的B. subtilisBF7658總DNA為模板，利用 PCR擴(kuò)增出中溫α–淀粉酶基因片段(GenBank 的登錄號為 FJ463162).測序結(jié)果表明中溫α–淀粉酶的信號肽含有 41個(gè)氨基酸，成熟肽含有 436個(gè)氨基酸.將中溫α–淀粉酶成熟肽基因片段amy經(jīng)HindIIIBamHI雙酶切，與HindIII-BamHI線性化的質(zhì)粒pWB980連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pWB-amy.將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pWB-amy轉(zhuǎn)化B. subtilisDB403，通過水解透明圈與菌落直徑比篩選活力高的重組菌株，在含有卡那霉素的 LB/瓊脂平板上挑取該陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒分別用HindIII和HindIII-BamHI進(jìn)行單酶切和雙酶切驗(yàn)證，電泳檢測結(jié)果(圖 1)表明重組子質(zhì)粒中已帶有目的基因amy，獲得重組菌株pWB-amy/DB403.

圖1 pWB-amy重組質(zhì)粒酶切圖Fig.1 Verification of recombinant plasmids with single and double enzyme digestion

2.2 重組酶AMY的表達(dá)

將pWB-amy/DB403、B. subtilisBF7658和pWB980/DB403分別點(diǎn)接到含 1%淀粉的 LB/瓊脂平板上，如圖 2所示.pWB-amy/DB403的水解透明圈與菌落直徑的比值明顯大于B. subtilisBF7658和pWB980/DB403.

將pWB-amy/DB403和pWB980/DB403在37,℃分別培養(yǎng) 36,h，收集上清液，SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)情況(圖 3)，pWB-amy/DB403的上清液中發(fā)現(xiàn)有相對分子質(zhì)量為 4.8×104的表達(dá)蛋白 AMY(泳道1)，與經(jīng)過純化的B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶(泳道 4)的大小一致，在 pWB980/DB403(泳道 3)上清液中未發(fā)現(xiàn)同樣的表達(dá)產(chǎn)物.同時(shí)，測定 pWB–amy/DB403上清液中溫α–淀粉酶 AMY的酶活力可達(dá)530,U/mL，而B. subtilisBF7658的中溫α–淀粉酶活力僅為 200,U/mL.按照方法 1.5所述對 pWB–amy/DB403進(jìn)行 7,L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，中溫α–淀粉酶AMY的酶活力可達(dá)770,U/mL.

圖2 α–淀粉酶活性的平板檢測Fig.2 Plate assay for activities of alpha amylase

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的聚丙烯凝膠電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of proteins secreted by B. subtilis DB403

2.3 重組酶的分離純化

收集 pWB-amy/DB403發(fā)酵上清液 100,mL，經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flow(2.4,cm×30,cm)離子交換層析、Sephadex G-75(1.6,cm×80,cm)凝膠層析，進(jìn)行純化.通過對重組酶 AMY 整個(gè)提純工藝各純化步驟的總蛋白、總酶活、比活、純度及回收率等指標(biāo)的跟蹤測定，得到 100,mL重組酶發(fā)酵上清液的純化表，見表 1.重組酶 AMY發(fā)酵上清液經(jīng)分離純化后，純度提高了 1.7倍，回收率為74.3%.重組酶AMY的粗酶液經(jīng)純化后，得到相對分子質(zhì)量為 4.8×104的單一電泳條帶(圖 3，泳道 2)，與經(jīng)過純化的B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶(圖3，泳道4)的大小一致.

表1 重組酶AMY純化表Tab.1 Summary of purification of recombinant AMY

2.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 酶的熱穩(wěn)定性

重組酶AMY及B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶反應(yīng)的最適溫度均為 60,℃.分別對 AMY及B.subtilisBF7658中溫α–淀粉酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果表明在 40,～80,℃保溫 60,min，殘余酶活分別為初始活力的90%、80%及50%(圖4和圖5)；在100,℃保溫30,min，完全失活.

圖4 重組酶AMY的熱穩(wěn)定性曲線Fig.4 Thermostability curve of recombinant AMY

圖5 B. subtilis BF7658中溫α -淀粉酶熱穩(wěn)定性曲線Fig.5 Thermostability curve of the medium-temperature alpha amylase in B. subtilis BF7658

2.4.2 酶的pH穩(wěn)定性

重組酶AMY及B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶的最適 pH為 6.0.分別對 AMY及B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶的pH穩(wěn)定性進(jìn)行分析(如圖6所示)，結(jié)果表明在60,℃保溫60,min，pH在5.5～7.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定.

圖6 B. subtilis BF7658中溫α-淀粉酶及AMY的pH穩(wěn)定性曲線Fig.6 Stability curve of pH of recombinant AMY and the medium temperature alpha amylase in B. subtilis BF7658

3 討 論

本項(xiàng)研究中，利用高效表達(dá)載體 pWB980，以 3個(gè)蛋白酶缺陷的B. subtilisDB403作為宿主菌株，實(shí)現(xiàn)了B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶的高效表達(dá)，經(jīng)發(fā)酵工藝優(yōu)化后，活力可達(dá)到770,U/mL，明顯高于出發(fā)菌株B. subtilisBF7658的中溫α–淀粉酶活力200,U/mL.董晨等[10]利用強(qiáng)啟動子 P43實(shí)現(xiàn)了地衣芽孢桿菌耐高溫α–淀粉酶在B. subtilis1A752S中的高水平表達(dá)，比原始菌株提高了 8.9倍.劉逸寒等[11]利用質(zhì)粒 pWB980與 6個(gè)蛋白酶缺陷的 B. subtilis WB600實(shí)現(xiàn)了突變耐酸性高溫α–淀粉酶的高效表達(dá)，活力可達(dá)到 4,700,U/mL.可見，由強(qiáng)啟動子高拷貝載體質(zhì)粒及本身胞外蛋白酶減少的枯草芽孢桿菌宿主菌株構(gòu)建的表達(dá)體系可有效提高產(chǎn)酶量.

重組酶 AMY經(jīng)超濾、硫酸銨鹽析、離子交換層析及凝膠層析純化后，得到的 AMY比活為35.8,U/mg，純化倍數(shù)為 1.7倍，獲得凝膠電泳條帶單一的蛋白樣品.在純化過程中，操作相對簡單且每步回收率較高，分析原因?yàn)橥庠吹鞍妆磉_(dá)量較高，同時(shí)由于宿主菌株B. subtilis DB403胞外蛋白分泌相對較少，穩(wěn)定了外源蛋白并簡化了純化過程.

重組酶AMY與B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶最適溫度均為 60,℃，在 40～80,℃保溫 60,min，殘余酶活分別為初始活力的 90%、80%及 50%；在100,℃保溫 30,min，完全失活.AMY 及B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶的最適 pH 為 6.0.分別對AMY及B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶的pH穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果表明在 60,℃保溫 60,min，pH 在5.5～7.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定.研究顯示，中溫α–淀粉酶經(jīng)過不同的宿主菌株表達(dá)后，催化性質(zhì)并沒有發(fā)生改變，保留原有的生物學(xué)活性.

外源基因的表達(dá)多采用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，提純蛋白需要將細(xì)胞破碎或裂解，過程繁瑣.而枯草芽孢桿菌具有將胞內(nèi)蛋白分泌到細(xì)胞外的特點(diǎn)引起人們的普遍關(guān)注，利用枯草桿菌的分泌特點(diǎn)，構(gòu)建高效表達(dá)體系表達(dá)外源蛋白，可簡化生產(chǎn)工序，有效降低生產(chǎn)成本.在本研究基礎(chǔ)上，下一步探索將B. subtilisBF7658中溫α–淀粉酶分別實(shí)現(xiàn)在分泌胞外蛋白酶更少的B. subtilisWB600中的游離及整合型表達(dá)，利用高拷貝質(zhì)粒或?qū)⒛康幕驑?gòu)建多個(gè)拷貝整合入宿主菌株基因組中，獲得安全高效穩(wěn)定的表達(dá)，為進(jìn)一步工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用在不同行業(yè)中的中溫α–淀粉酶奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

［1］李文德，路義，周明琨. 枯草桿菌 BF7658α–淀粉酶在釀造工業(yè)上的應(yīng)用[J]. 中國調(diào)味品，1995(10)：17–19.

［2］劉仲敏，張新武，曹明照，等. 以玉米粉代替部分玉米淀粉生產(chǎn)中溫α–淀粉酶的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(6)：96–97.

［3］Wong S L. Advances in the use ofBacillus subtilisfor the expression and secretion of heterologous proteins[J].Current Opinion in Biotechnology，1995，6(5)：517–522.

［4］Wu S C，Wong S L. Development of improved pUB110-based vectors for expression and secretion studies inBacillus subtilis[J]. Journal of Biochemistry，1999，72(1/2)：185–195.

［5］蔡恒，陳忠軍，李金霞，等.α–淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(10)：33–36.

［6］Yasbin R E，Wilson G A，Young F E. Transformation and transfection in lysogenic strains ofBacillus subtilis：Evidence for selective induction of prophage[J]. Journal of Bacteriology，1975，121(1)：296–304.

［7］Liu Y H，Lu F P，Li Y，et al. Characterisation of mutagenised acid-resistant alpha amylase expressed inBacillus subtilisWB600[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78(1)：85–94.

［8］Lowry O H，Rosbrough N L，F(xiàn)arr A L. Protein measurement with folin phenol reagent[J]. The Journal of Biological Chemistry，1951，193(1)：2265–2275.

［9］孫靜，路福平，劉逸寒，等. 枯草芽孢桿菌工程菌產(chǎn)中溫α–淀粉酶發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國釀造，2009，5：265–268.

［10］董晨，曹娟，張跡，等. 耐高溫α–淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2008，14(4)：2534–2538.

［11］Liu Y H，Lu F P，Li Y，et al. Acid stabilization of Bacillus licheniformisalpha amylase through introduction of mutations[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，80(5)：2795–2803.

High-Level Expression of the Medium-Temperature Alpha Amylase inBacillus subtilis

LIU Yi-han，LU Fu-ping，WANG Jian-ling，HU Bo
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

The medium-temperature alpha amylase gene fromBacillus subtilisBF768 was cloned into vector pWB980 and high-level expressed inB. subtilisDB403. The activity of AMY in the supernatant of the culture medium reached a maximum of 770 U/mL. By multi-step purification，the specific activity of AMY was up to 35.8 U/mg with a 1.7-fold purification. The recombinant enzyme AMY had a molecular mass of 4.8×104. The optimum pH and temperature of AMY was 6.0 and 60 ℃.

Bacillus subtilis；medium-temperature alpha amylase；high-level expression；purification；enzyme properties

Q814.4

A

1672-6510(2011)04-0001-05

2011–03–23；

2011–05–27

天津市科技攻關(guān)重點(diǎn)培育項(xiàng)目(06YFGPSH03500)；天津科技大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20090205)

劉逸寒（1982—），男，天津人，講師，博士，lyh@tust.edu.cn.