王朋云,茅云翔,孔凡娜,馬 梅,馬 飛

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與基因資源利用教育部重點實驗室,山東青島266003)

叢粒藻(Botryococcus braunii)[1],又名布朗葡萄藻,屬綠藻門(Chlorophyta)、共球藻綱(Trebouxiophyceae)、叢粒藻科(Botryococcaceae)、叢粒藻屬(Botryococcus),是1種營聚落生活的單細胞綠藻[2]。研究發(fā)現(xiàn),叢粒藻在生長過程中能夠大量合成并儲存多種烴類物質(zhì),其總烴含量一般超過細胞干重的30%,最高可達86%[3-4]。研究還證明,叢粒藻是構成石油生烴母質(zhì)的主要成分[5-7],所產(chǎn)生的烴類物質(zhì)熱值較高[8]。因此,該藻被認為是一種潛在的可再生生物燃料來源。

叢粒藻廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶和溫帶的淡水和微咸水湖等水體中[9]。不同地理株系間具有形態(tài)多樣性,細胞形狀大小、膠質(zhì)鞘包埋程度、細胞排列方式、聚落細胞數(shù)目和連接方式等均存在差異,這些形態(tài)指標是叢粒藻分屬、定種的主要指標[10]。同時,研究還證明不同來源叢粒藻合成的烴類物質(zhì)也存在顯著差異[11-13]。叢粒藻形態(tài)多樣性與生化多樣性的基礎在于不同來源藻株的遺傳差異。

本研究以3株不同來源的叢粒藻為實驗材料,一方面通過觀察顯微和亞顯微結構,克隆并分析18S～28S rDNA序列特征,為叢粒藻的形態(tài)分類和分子鑒定提供系統(tǒng)的數(shù)據(jù);另一方面研究叢粒藻不同株系間形態(tài)多樣性-遺傳多樣性的關系,結合生理生化數(shù)據(jù),將為優(yōu)良藻株的遺傳選育提供資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藻株 實驗中所用3株叢粒藻AGBBb01、AGB-Bb02和A GB-Bb03均來自于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫,其中AGB-Bb01采集自英國劍橋(原始藻株編號U TEX 572),AGB-Bb02采集自中國云南(原始藻株編號FACHB-759),AGB-Bb03采集自中國湖北(原始藻株編號FACHB-775)。藻株均培養(yǎng)于Chu10培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度(23±1)℃,光暗周期比12 h∶12 h,光照強度25μmol·m-2·s-1。

1.1.2 菌株和克隆載體 基因克隆載體為pMD18-T,宿主菌株為E.coli DH5α,均購自TaKaRa公司。

1.1.3 試劑盒、工具酶和試劑 PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)購自OM EGA公司,Taq酶等PCR試劑購自MBI公司,試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 光學顯微鏡樣品處理 取對數(shù)生長期藻液滴于載玻片上制成臨時裝片,直接在Olympus顯微鏡下觀察并顯微拍照,測量指標包括細胞長度、細胞寬度、聚落長度、聚落寬度、聚落細胞數(shù)目,每株微藻觀察聚落數(shù)為30個。

1.2.2 掃描電鏡樣品處理 取1 m L對數(shù)生長期藻液于圓底離心管,800 r/min離心10 min收集藻細胞,加入1 m L 1%戊二醛固定(4℃過夜),1 000 r/min離心10 min,用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次,然后依次用30%,50%,70%,90%,100%乙醇進行逐級脫水,用吸管將含有樣品的乙醇溶液滴在有明膠膜的蓋玻片上,可防止細胞被沖走,采用臨界點干燥法干燥,離子濺射鍍膜法鍍膜[14]。

1.2.3 基因克隆 取對數(shù)生長期藻液,4℃下8 000 r/min離心10 min收集藻細胞,無菌水洗滌2次。將藻細胞于液氮中充分研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管,用酚氯仿法提取微藻基因組DNA[15]。

根據(jù)NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的叢粒藻序列設計引物,PCR擴增產(chǎn)物包含大部分18S rDNA、ITS區(qū)和小部分28S rDNA序列片段(見圖1),所用引物由上海英俊(Invitrogen)生物技術有限公司合成。正向引物序列S1F:5’-TGCCAGTAGTCA TA TGCTT GTC-3’;反向引物序列S2R:5’-TAAGTTCAGCGGGTGCTCTTAC-3’。

圖1 叢粒藻18S～28S rDNA序列結構和引物結合位點Fig.1 The arrangment of the 18S～28S rDNA sequences and binding site of primers in B.braunii

PCR擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸2 min,30個循環(huán);72℃延伸5 min。

PCR擴增產(chǎn)物用OM EGA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)回收后用T4 DNA連接酶將目標片段連接到質(zhì)粒載體pMD18-T上,轉(zhuǎn)入E.coli DH5α,由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 核酸序列分析 核酸序列同源性分析采用NCBI blastn在線程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。多序列對位分析采用Bio Edit(version 7.0.5.2)包含的Clustal Wpackage(參數(shù)設定為gap open penalty=15,gap extend penalty=6.66);系統(tǒng)進化樹構建采用M EGA 3.1 Unweighted Pair-Group Method Using(NJ),Kimura 2-parameter計算遺傳距離值(重復1000次計算bootstrap值)。

2 結果

2.1 叢粒藻細胞形態(tài)特征及不同藻株間的差異

顯微觀察發(fā)現(xiàn),3株叢粒藻藻細胞均呈黃綠色,細胞側面觀卵形或?qū)捖研?頂面觀圓形。藻細胞色素體單個片狀側生,位于細胞底部至中部;胞內(nèi)有數(shù)個至數(shù)十個大小不等的球狀小顆粒,內(nèi)為淀粉或油滴。細胞基部埋藏于藻落的透明膠質(zhì)中,符合叢粒藻的形態(tài)學特征(見圖2)。藻細胞合成的烴類物質(zhì)大部分運輸?shù)郊毎?胞外烴呈顆粒狀儲存在細胞壁中。測量結果顯示,3株藻在細胞大小(見表1)、聚落大小和聚落細胞數(shù)目方面存在較明顯的差異(見表2)。其中,藻株AGB-Bb03細胞最大,而AGB-Bb02細胞最小;藻株A GB-Bb03聚落最大,聚落細胞數(shù)目最多,而AGBBb02聚落最小,AGB-Bb01聚落細胞數(shù)目最少。

圖2 3株叢粒藻細胞形態(tài)顯微觀察Fig.2 Mo rphological characters of different strains of B.braunii observed under lightmicroscope

表1 不同株系叢粒藻細胞大小Table 1 Cell size of different strainsof B.braunii

掃描電鏡下,可見藻細胞基部至中上部被母細胞壁殘余加厚形成的杯狀結構包被,頂部裸露不具加厚的細胞壁。3株微藻杯狀鞘的厚度及細胞的包埋程度略有差別:AGB-Bb02的細胞壁較厚,AGB-Bb03次之,AGB-Bb01最薄;AGB-Bb02細胞大部分被杯狀細胞壁包埋,僅頂部小部分未被杯狀鞘包被,AGB-Bb01和AGB-Bb03的細胞包埋程度不及前者,杯狀鞘約至細胞中上部。聚落通常是由2、4、8或更多的細胞通過膠絲連接成葡萄串狀的集結體或復合集結體,膠絲長短各異且形狀不規(guī)則,細胞在聚落表面略呈輻射排列(見圖3)。

表2 叢粒藻不同株系聚落大小和聚落細胞數(shù)目Table 2 Colony size and cell numbersof the different strains of B.braunii

圖3 3株叢粒藻細胞掃描電子顯微鏡觀察Fig.3 Morphological and structural characters of three different strains of B.braunii observed by a scanning electron microscope

2.2 叢粒藻遺傳多樣性

PCR擴增產(chǎn)物分子量約為2 500 bps,包含18S rDNA、ITS區(qū)和28S rDNA序列片段。采用NCB I blastn在線程序進行核酸序列同源性分析,結果顯示3株實驗藻株的18S-28S rDNA序列與GenBank公共核酸數(shù)據(jù)庫中叢粒藻的相關序列高度相似,其中AGBBb01與B.braunii Titicaca序列相似性為91.02%,A GB-Bb02與B.braunii Songkla Nakarin序列相似性為94.42%,AGB-Bb03與B.braunii Ayame序列相似性為99.60%。結果表明3株實驗藻株均為叢粒藻,但不同藻株間存在遺傳差異。將3株實驗藻株的序列向GenBank公共核酸數(shù)據(jù)庫提交,獲得登錄號為GU 951518、GU 951519、GU 951520。

2.2.1 基于18S rDNA的遺傳多樣性分析 去除引物序列后,18S rDNA序列長度分別為A GB-Bb01 1755bp、A GB-Bb02 1753bp,A GB-Bb03 1754bp,將本文克隆的18S rDNA序列分別與公共核酸數(shù)據(jù)庫(GenBank)中已登錄的叢粒藻相應序列,可以發(fā)現(xiàn)不同藻株相應序列之間存在堿基數(shù)目的差別(見表3)。

遺傳距離和序列相似性分析結果顯示:8株叢粒藻中遺傳親緣關系最近的是采自湖北武漢的藻株AGBBb03與源于非洲科特迪瓦的藻株Ayame,其遺傳距離和序列相似性分別為0.001 1和0.998 3;遺傳親緣關系最遠的是采自云南撫仙湖的藻株A GB-Bb02與源于美國明尼蘇達艾塔斯卡湖的藻株Tow 9/21 P-16w,遺傳距離和相似性分別為0.040 0和0.957 9。8株叢粒藻之間的平均遺傳距離為0.025 2,平均序列相似性為0.972 7;而與同科不同屬的Botryosphaerella sudetica U TEX 2629親緣關系最近的是藻株AGB-Bb01,二者之間的遺傳距離值為0.102 0,序列相似性為0.902 7(見表4)。

以與叢粒藻同科但不同屬的南向球葡萄藻Botryosphaerella sudetica U TEX 2629相關序列為外群采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,8株藻可劃分為2個簇群(見圖4)。在本文實驗研究的3株微藻中,AGB-Bb02與AGB-Bb03親緣關系更近,屬于同一簇群;其中AGB-Bb03首先與源自科特迪瓦的Ayame株聚群(支持率100%,遺傳距離值0.001 1,序列相似性0.998 3),AGB-Bb02則先與源自泰國的Songkla Nakarin株聚群(支持率99%,遺傳距離值0.007 5,序列相似性0.992 6)。而AGB-Bb01則屬于另一簇群,與源于玻利維亞的Titicaca株和美國明尼蘇達的Tow 9/21 P-16w親緣關系更近(支持率為99,遺傳距離值0.009 8,序列相似性0.988 0)。藻株Ayame和AGB-Bb03的序列相似性最大(0.998 3),AGB-Bb02和Tow 9/21 P-16w的序列相似性最小(0.957 9),8株叢粒藻的序列相似性均值為0.972 7。

表3 用于系統(tǒng)樹構建的叢粒藻18S rDNA和ITS區(qū)域的基本信息Table 3 Basic characters of 18S rDNA and ITS region of Botryococcus fo r phylogenetic tree construction

表4 基于18S rDNA序列的不同叢粒藻藻株的遺傳距離和序列相似性Table 4 Genetic distances and sequence similarities of different Bot.strains based on 18S rDNA sequences

圖4 基于18S rDNA序列的叢粒藻系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of genus Bot.based on 18S rDNA sequences using Neighbor-Joining method

2.2.2 基于ITS區(qū)序列的遺傳多樣性分析 本文克隆的3株叢粒藻ITS區(qū)序列長度分別是AGB-Bb01 687bp、AGB-Bb02 613bp和AGB-Bb03 653bp。比較全部14株相關序列已知的叢粒藻,發(fā)現(xiàn)5.8S rDNA核苷酸長度一致,均為159bp,顯示出遺傳上的穩(wěn)定性;但5.8S rDNA的GC含量、ITS1和ITS2長度及堿基使用偏好變化很大,又顯示出藻株間的遺傳多樣性(見表3)。

遺傳分析顯示:在14株叢粒藻中,源于英國劍橋的藻株AGB-Bb01與源于澳大利亞新南威爾士的藻株Jillamatong具有最近的親緣關系,遺傳距離和序列相似性分別為0.002 3和0.988 4;親緣關系最遠的是源自英國坎布里亞的CCAP807/2與科特迪瓦藻株Yamoussoukro,遺傳距離和序列相似性分別為0.494 8和0.577 4。14株叢粒藻之間的平均遺傳距離為0.327 5,平均序列相似性為0.663 9;而與近緣屬物種Botryosphaerella sudetica U TEX 2629的平均遺傳距離為0.678 0,平均序列相似性為0.463 6(見表5)。數(shù)據(jù)分析表明叢粒藻藻株的5.8S rDNA-ITS位點具有較高的遺傳多態(tài)性,可用于不同藻株基因分型研究。同時數(shù)據(jù)分析也表明,盡管種內(nèi)不同藻株之間遺傳距離較大,序列相似性也較低,但與近緣物種相關數(shù)據(jù)比較仍有顯著差異,因此該位點也可用于鑒定種屬間的差異。

圖5 用鄰接法重建的基于叢粒藻ITS區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining tree of Bot.based on ITS region sequences

以B.sudetica U TEX 2629的ITS區(qū)序列為外群重建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,所有叢粒藻藻株可以分為2大簇群(見圖6),完全支持了18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)生樹對叢粒藻親緣關系的劃分。本實驗研究的3株叢粒藻顯示出遺傳上的差異,AGB-Bb02和AGB-Bb03屬于同一個簇群,而AGB-Bb01屬于另一個簇群。AGBBb01與來自秘魯庫斯科的U TEX 2441及澳大利亞新南威爾士的Jillamatong聚為1個分支(支持率100,遺傳距離值0.002 3,序列相似性0.988 4);源自云南撫仙湖的AGB-Bb02先與源自泰國的Songkla Nakarin聚群(支持率93,遺傳距離值0.153 9,序列相似性0.804 4),再與來自科特迪瓦的Yamoussoukro聚在一起;源自湖北武漢的A GB-Bb03則在與A yame聚群后(支持率為100,遺傳距離值0.004 5,序列相似性0.990 9),再依次與2株來自美國明尼蘇達的FDCC CH28、CH86聚為1個分支。另外,系統(tǒng)發(fā)生樹還顯示叢粒藻2大簇群各包含7個藻株,而每個簇群又可進一步細分為不同的亞簇,表明不同藻株之間遺傳上的多樣性。

表5 基于ITS區(qū)序列的不同叢粒藻藻株的遺傳距離和序列相似性Table 5 Genetic distances and sequence similarities of different strains based on ITS region sequences

3 討論

3.1 叢粒藻的分類鑒定技術

微藻藻種鑒定工作要求研究者具有豐富的經(jīng)驗,所依據(jù)的形態(tài)特征需要借助光學顯微鏡來觀察,某些細節(jié)特征還需進一步借助電子顯微鏡。但由于微藻細胞形態(tài)的可塑性,在不同的環(huán)境下往往出現(xiàn)明顯的差異,因此依據(jù)形態(tài)的鑒定結果常常出現(xiàn)同種異名或同名異種的情況。利用基因序列分析判斷藻株的親緣關系是形態(tài)觀察的輔助手段,特別是形態(tài)上難以區(qū)別的藻株,二者結合能夠?qū)ξ⒃宸诸愄峁└嗟囊罁?jù),結果的準確性也更有保證。

叢粒藻的鑒定方法主要有形態(tài)觀察、基因序列分析及化學成分檢測3種。根據(jù)不同地理株形態(tài)上的差別,Komarek和M arvan[16]將叢粒藻屬分為13個種。本研究也表明不同地理來源的叢粒藻藻株在細胞大小、聚落大小和聚落細胞數(shù)目方面存在較明顯的差異,電鏡觀察不同藻株的亞顯微結構也顯示其杯狀鞘厚度及細胞包埋程度存在差異。但是否可依據(jù)這些特征將其分為不同的種,仍需開展深入的研究。

叢粒藻在代謝過程中能夠合成不同的烴類,研究發(fā)現(xiàn)不同的藻株所合成烴的種類具有特異性,因此Plain等人提出[17]將產(chǎn)烴種類相同的種歸為同一化學族(Race)。根據(jù)所合成烴類的類型,目前將叢粒藻分為A、B、L和Gb 4個化學族[18-20]。

本研究表明,叢粒藻18S rDNA位點具有一定的多態(tài)性,而ITS區(qū)位點多態(tài)性極高,因此將二者結合起來可用于從屬、種至地理株系等不同分類階元的分子鑒定。本研究依據(jù)核苷酸序列信息所有藻株可分為2大簇群和4個亞群,但分子鑒定的劃分方式與依據(jù)形態(tài)特征區(qū)分的種、亞種或地理種的對應關系尚待進一步的研究。Senousy等人[2]分析了不同化學族藻株的18S rDNA序列,發(fā)現(xiàn)利用核苷酸序列區(qū)分的類群與化學分類方法具有一致性。因此,利用分子遺傳學方法鑒定藻株的基因型,可迅速了解其化學組成特性,提高了研究效率。

3.2 叢粒藻遺傳多樣性

核基因組中的18S rRNA、ITS區(qū)序列和葉綠體基因組中的rbcL基因、matK基因、trnL內(nèi)含子和trnLF基因間隔區(qū)、ndhF基因、atpB基因以及線粒體基因組中的cox I、atpA基因是目前植物分子系統(tǒng)學研究中的常用片段[21]。本文共分析了16株叢粒藻藻株的18S rDNA序列和ITS區(qū)序列,結果未見序列完全相同的藻株,結合形態(tài)學觀察顯示叢粒藻遺傳多樣性較高,也表明分布于世界不同地點的叢粒藻存在一定程度的地理隔離。

叢粒藻作為1種具有潛在應用價值的能源微藻,制約其應用的最大的障礙在于其生長速度很慢,但叢粒藻豐富的遺傳多樣性為分離篩選快速生長藻株,或通過遺傳育種技術培育速生藻株提供了豐富的遺傳材料。

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