鄧春梅，姚 鵬，于志剛，牛增元

（1．國家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測中心海洋溢油鑒別與損害評估技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266033；2．中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266100；3．山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266002）

基于反相C8色譜柱的海洋浮游藻色素高效液相色譜分析方法有效性驗(yàn)證＊

鄧春梅1，姚 鵬2＊＊，于志剛2，牛增元3

（1．國家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測中心海洋溢油鑒別與損害評估技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266033；2．中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266100；3．山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266002）

對一種海洋浮游藻色素高效液相色譜分析方法進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。該方法使用反相C8色譜柱，以甲醇、乙腈和丙酮為流動相，并在流動相中添加吡啶／醋酸溶液作為修飾劑改善色素峰的分離效果。結(jié)果表明，4種色素標(biāo)準(zhǔn)在一定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，葉綠素a的線性范圍為189．6～18 960μg／L，葉綠素b為89．2～8 920μg／L，β，β－胡蘿卜素為7．77～777．2μg／L，葉黃素為15．28～1 528μg／L。除β，β－胡蘿卜素外各色素標(biāo)準(zhǔn)的回收率在不同濃度下均在90%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也普遍低于5%。在4個參考藻種和123個膠州灣現(xiàn)場樣品中共檢測出37種色素，一些關(guān)鍵的特征色素均獲得了良好的分離效果。該方法操作簡便，具有分離度好、靈敏度高、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于培養(yǎng)的藻種和現(xiàn)場樣品中的海洋浮游藻色素分析。

海洋浮游藻；色素；高效液相色譜；有效性驗(yàn)證

海洋浮游藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者，在物質(zhì)循環(huán)與能量轉(zhuǎn)換過程中起著重要作用［1］。對浮游藻群落組成和豐度的估計(jì)對于理解浮游生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能及其動力學(xué)過程有重要意義［2］。不同種類的浮游藻具有不同的色素種類和特征色素比值，許多色素之間都有很強(qiáng)的化學(xué)分類學(xué)的聯(lián)系，可以用來確定海洋學(xué)意義上的浮游藻群落組成和豐度［3］。近年來，以高效液相色譜（HPLC）色素分析為基礎(chǔ)的海洋浮游藻化學(xué)分類方法由于具有適合大批量樣品快速分析等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為一種從宏觀上對浮游藻群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性與定量分析的重要方法，在世界各地海洋環(huán)境中得到了廣泛應(yīng)用［4－5］。

對現(xiàn)場樣品進(jìn)行色素分析是應(yīng)用化學(xué)分類方法的第一步也是最重要的一步。Zapata等［6］建立的以C8反相色譜柱為基礎(chǔ)，并通過在流動相中添加吡啶作為修飾劑來改善峰形的二元梯度方法被認(rèn)為是目前分離效果最好、最有前途的一個海洋浮游藻色素分析方法，國際上對于其應(yīng)用日益增多［7－9］，但是在國內(nèi)其應(yīng)用還不是很廣泛［10－13］。考慮到Zapata等人并沒有給出該方法的有效性驗(yàn)證，而且不同的實(shí)驗(yàn)室所使用的儀器、試劑以及耗材都不同，本文通過對色素標(biāo)準(zhǔn)、參考藻種和現(xiàn)場樣品的分析，參照HPLC校正的通用方法［14－15］考察了這一方法的線性、精密度、回收率、檢測限、定量限、分離度等指標(biāo)，以期建立一套完整的海洋浮游藻HPLC色素分析有效性驗(yàn)證方法，為該方法在不同實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用以及今后新的色素分析方法的研究和比較提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器、試劑與材料

Waters Alliance 2695HPLC系統(tǒng)，配有Waters 2996二極管陣列檢測器（PDA，檢測波長350～750 nm）和Waters 2475熒光檢測器（FD，Ex＝440nm，Em＝650nm）；Milli－Q超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）；SK250H型高頻超聲波儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；GXZ－300B光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）；MDF－382E超低溫冰箱（日本三洋公司）。

4種色素標(biāo)準(zhǔn)，包括葉綠素a（C－5753）、葉綠素b（C－5878）、β，β－胡蘿卜素（C－4582）和葉黃素（X－6250），均購自美國Sigma化學(xué)試劑公司（St．Louis，USA）。這些色素標(biāo)準(zhǔn)均為固體，在使用之前需要配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，并經(jīng)過純度檢驗(yàn)和濃度確定［17］；甲醇、乙腈、丙酮為色譜純（美國Fisher公司）；醋酸、吡啶為國產(chǎn)優(yōu)級純（天津博迪公司）；超純水（電阻率為18．2MΩ·cm）為自制。

4種已知色素組成的海洋浮游藻作為參考藻種輔助進(jìn)行色素的定性，包括諾氏海鏈藻（Thalassiosira nordenskioeldii）、裸甲藻（Gymnodiniumsp．）、赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）和亞心型四爿藻（Tetraselmis subcordiformis），它們分屬4個不同的浮游藻綱（硅藻、甲藻、針胞藻和綠藻），色素組成具有較大差異［10－11，16－17］。

1．2 實(shí)驗(yàn)步驟

1．2．1 藻種培養(yǎng)和收獲 藻種生長在光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度范圍為40～70μmol quanta／m2／s，光暗周期比為12h∶12h，生長溫度為18℃。藻種在指數(shù)生長期末尾收獲，約10mL收獲的藻種培養(yǎng)液（細(xì)胞密度約在105個／mL）在弱真空（＜0．03MPa）和微光下被過濾到47mm Whatman GF／F玻璃纖維濾膜上。濾膜在分析之前于－20℃下冷凍保存（保存時間不超過72h）。

1．2．2 現(xiàn)場樣品采集 在膠州灣布設(shè)站位采集了7個航次123個表層海水樣品，1L海水水樣在弱真空（＜0．03MPa）和微光下過濾到47mm Whatman GF／F玻璃纖維濾膜上。濾膜在分析之前于－80℃下冷凍保存以減小色素轉(zhuǎn)化（保存時間不超過3個月）。

1．2．3 色素提取 將冷凍的濾膜剪碎，用1．5～3mL 95%甲醇（甲醇∶水＝95∶5，v／v）提取色素，并在冰水浴中超聲處理5min。提取物通過PTFE濾膜針筒濾器（英國Whatman公司）過濾以去除細(xì)胞和濾膜碎屑。為了避免色素峰的變形，250μL的提取液和50μL的Milli－Q水混合，混合后立即進(jìn)樣（混合后無沉淀產(chǎn)生）。所有的操作均在暗室中進(jìn)行以避免光照破壞色素。

1．3 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C8柱（150mm×4．6 mm，3．5μm粒徑，100?孔徑），恒溫25℃；流動相：A＝甲醇∶乙腈∶吡啶／醋酸溶液（50∶25∶25v／v／v），B＝甲醇∶乙腈∶丙酮（20∶60∶20v／v／v），吡啶／醋酸溶液的配制方法如下：在2L的玻璃燒杯中加入900 mL Milli－Q水，然后分別加入20mL吡啶和10mL醋酸，在攪拌的過程中滴加醋酸直到pH變?yōu)?．0，然后將溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶，并用Milli－Q水定容到1L［6］。流動相在配好之后先用0．45μm GHP濾膜（美國Pall公司）過濾，然后超聲脫氣20～30min；梯度洗脫程序：0～22～28～38～40min，0%B～40%B～95%B～95%B～0%B；進(jìn)樣量為100μL；流速為1．0mL／min。每一次運(yùn)行之后使用一個進(jìn)樣環(huán)體積（100μL）的30%甲醇（甲醇∶水＝30∶70，v／v）對自動進(jìn)樣器進(jìn)行自動清洗。葉綠素和類胡蘿卜素用PDA進(jìn)行檢測（波長范圍350～750nm，光譜分辨率1．2nm），葉綠素同時也用FD輔助檢測。色素的定性通過與色素標(biāo)準(zhǔn)、相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果的保留時間和光譜性質(zhì)進(jìn)行比較確定，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。因?yàn)榇蟛糠稚卦?40nm下有吸收，所以后續(xù)的計(jì)算均是針對440nm下的色譜圖。

2 結(jié)果與討論

2．1 方法的線性范圍和相關(guān)系數(shù)

根據(jù)現(xiàn)場樣品中各色素的大致濃度比例，精確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，共包括8個工作曲線點(diǎn)，各色素標(biāo)準(zhǔn)的起始質(zhì)量濃度分別為：葉綠素a為189．6μg／L，葉綠素b為89．2μg／L，β，β－胡蘿卜素為7．77μg／L，葉黃素為15．28μg／L，然后按照2、4、10、15、20、40、100的倍數(shù)遞增。色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液按濃度從低到高依次進(jìn)樣，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（X，μg／L）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)如表1所示。圖1為色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液第4個濃度點(diǎn)440nm下的色譜圖。4種色素標(biāo)準(zhǔn)在標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的整個質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（葉綠素a為189．6～18 960μg／L，葉綠素b為89．2～8 920μg／L，β，β－胡蘿卜素為7．77～777．2 μg／L，葉黃素為15．28～1 528μg／L）線性關(guān)系均較好，線性相關(guān)系數(shù)為0．999 93～0．999 99，完全可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液工作曲線第4個濃度點(diǎn)的色譜圖（440nm）Fig．1 Chromatogram of a mixed solution of 4pigment standards at the fourth point of working curve（440nm）

表1 4種色素標(biāo)準(zhǔn)的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equations，linear ranges and correlation coefficients of 4pigment standards

2．2 方法的檢測限和定量限

在1．3節(jié)所述的實(shí)驗(yàn)條件下，將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)連續(xù)進(jìn)樣7次，測定各化合物的峰面積，然后按照式1計(jì)算出本方法對各色素標(biāo)準(zhǔn)的檢測限。

上式中MDL代表檢測限（Method Detection Limit，μg／L），t（n－1，0．99）為在99%置信度下雙側(cè)t檢驗(yàn)的臨界值，而n－1代表自由度。當(dāng)n＝7的時候，t（6，0．99）＝3．707。SDistandard為各色素標(biāo)準(zhǔn)7次進(jìn)樣峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差，F(xiàn)i為各色素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率（見表1）。

對于分析方法的定量限一般選擇多次重復(fù)測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍來設(shè)定［14］。在本實(shí)驗(yàn)中，以3倍的檢測限來設(shè)定定量限（實(shí)際上為3．707×3＝11．121倍標(biāo)準(zhǔn)偏差）。4種色素標(biāo)準(zhǔn)的儀器檢測限和定量限結(jié)果如表2所示，完全能滿足實(shí)際樣品檢測和定量需要。

表2 方法的檢測限和定量限Table 2 Method detection and quantitation limits

2．3 方法的精密度和回收率

取色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液第2個濃度點(diǎn)，即4種色素標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度分別為：葉綠素a 379．2μg／L，葉綠素b 178．4μg／L，β，β－胡蘿卜素15．54μg／L和葉黃素30．56μg／L的溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別計(jì)算各色素標(biāo)準(zhǔn)的保留時間和峰面積的精密度，各色素標(biāo)準(zhǔn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如表3所示。由表3可見，其標(biāo)準(zhǔn)保留時間的RSD均小于0．03%，峰面積RSD為1．01%～3．07%，可見該方法的精密度良好。

表3 4種色素標(biāo)準(zhǔn)的保留時間和峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Relative standard deviation of retention time and peak area of 4pigment standards

表4 空白樣品中4種色素標(biāo)準(zhǔn)的加標(biāo)回收率（n＝3）Table 4 Recoveries of 4pigment standards spiked in a blank sample（n＝3）

圖2 4個參考藻種和1個膠州灣代表性采樣站位色素樣品的色譜圖（440nm）Fig．2 Chromatograms of 4reference marine phytoplankton species and 1representative sampling site of Jiaozhou Bay（440nm）．Peak identifications as in Table 5

為進(jìn)一步檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性，本研究通過添加空白實(shí)驗(yàn)方法測定了該方法的回收率。具體方法為：將空白濾膜作為樣品，分別添加低、中、高3個濃度級別的標(biāo)準(zhǔn)溶液（分別取色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的第2、4和6個濃度點(diǎn)）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測定3次，對結(jié)果取平均值，結(jié)果見表4。從回收率數(shù)據(jù)可以看出，除β，β－胡蘿卜素外各色素標(biāo)準(zhǔn)的回收率在不同濃度下均在90%以上，RSD也普遍低于5%。β，β－胡蘿卜素在3種濃度下的回收率均在80%～90%之間，RSD均＜10%?？偟膩砜丛摲椒梢暂^好地滿足藻類樣品中色素化合物含量測定的要求。

2．4 分離度

在1．2和1．3節(jié)所述的實(shí)驗(yàn)步驟和色譜條件下，測定了4種參考藻種和7個航次123個膠州灣現(xiàn)場樣品［12］中的色素組成，代表性色譜圖如圖2所示，所檢測出的色素如表5所示。根據(jù)式2計(jì)算樣品中相鄰色素的分離度。表5中的數(shù)據(jù)為樣品分析結(jié)果的平均值。

上式中tR1和tR2分別為色素峰1和2的洗脫時間，wB1和wB2分別是色素峰1和2的寬度（單位為min）。色素峰分離度越大表明2個色素分離效果越好，分離值小于1．0則意味著2個相鄰色素沒有完全分離［14］。

表5 參考藻種和膠州灣現(xiàn)場樣品中檢測出的色素峰鑒定表Table 5 Identification table of pigment peaks detected in reference species and field samples from Jiaozhou Bay

分離度計(jì)算結(jié)果如表5所示，可以看到，大部分色素都能獲得良好的分離，有8對先后流出的色素沒有得到完全分離，它們是MgDVP和葉綠素c2、micromonol和紫黃素、甲藻黃素和百合黃素、硅藻黃素和藍(lán)隱藻黃素、玉米黃素和葉黃素、葉綠素a異質(zhì)同晶體和葉綠素a、葉綠素a和葉綠素a差向異構(gòu)體、β，ε－胡蘿卜素和β，β－胡蘿卜素，其中尤以甲藻黃素和百合黃素最接近，兩者的洗脫時間相差在0．3min以內(nèi)。一般的HPLC色素分析方法中，葉綠素c2和c1往往作為一個峰同時被洗脫（包括曾被聯(lián)合國教科文組織所推薦的使用C18柱的Wright方法［18］），在本方法中，這2個色素得到了完全分離。玉米黃素和葉黃素的分離是所有HPLC色素分析方法的難點(diǎn)，很多方法也將其作為1個峰洗脫，在本方法中，雖然未能實(shí)現(xiàn)基線上的分離，但是可以部分分離（分離度為0．81），2種色素以2個峰先后流出。在這37種色素中有10種是在參考藻種中未檢出的，如19′－丁酰氧基巖藻黃素、19′－己酰氧基巖藻黃素、青綠藻黃素、尿酸內(nèi)酯、別黃素等，主要來自于金藻、定鞭藻、青綠藻（含青綠藻黃素的種類）和隱藻，是這些藻類的特征色素，這些色素的確定需要結(jié)合文獻(xiàn)資料中的結(jié)果，依據(jù)保留時間和紫外－可見光譜特征的比較作出。

3 結(jié)語

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法考察了一種基于反相C8色譜柱的海洋浮游藻色素高效液相色譜分析方法的有效性，包括方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、精密度和回收率、檢測限和定量限、分離度等。結(jié)果表明，通過采用色素標(biāo)準(zhǔn)、參考藻種和文獻(xiàn)資料結(jié)合的方法，可以對樣品中的色素進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量。該方法操作簡便，具有分離度好、靈敏度高、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于培養(yǎng)的藻種和現(xiàn)場樣品中的海洋浮游藻色素分析。

［1］ Jeffrey S W，Wright S W．Photosynthetic Pigments in Marine Microalgae：Insights from Cultures and the Sea．In Subba Rao D V（editor）．Algal Cultures，Analogues of Blooms and Applications［M］．Enfield：Science Publishers，2006：33－90．

［2］ 于志剛，米鐵柱，姚鵬，等．赤潮藻鑒定與定量檢測方法進(jìn)展［J］．中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，39（5）：1067－1076．

［3］ Wright S W，Jeffrey S W．Pigment Markers for Phytoplankton Production．In Volkman J K（editor）．Marine Organic Matter：Biomarkers，Isotopes and DNA，the Handbook of Environmental Chemistry，Vol．2N［M］．Berlin：Springer，2006：71－104．

［4］ 姚鵬，于志剛，米鐵柱．海洋浮游藻類的化學(xué)分類法［J］．海洋環(huán)境科學(xué)，2003，22（1）：75－80．

［5］ 鄧春梅，姚鵬，劉淑霞，等．海洋浮游藻色素分析和化學(xué)分類研究進(jìn)展［J］．中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，40（4）：91－98

［6］ Zapata M，Rodríguez F，Garrido J L．Separation of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton：a new HPLC method using a reversed phase C8column and pyridine－containing mobile phases［J］．Mar Ecol Prog Ser，2000，195：29－45．

［7］ Zapata M，Jerrrey S W，Wright S W，et al．Photosynthetic pigments in 37species（65strains）of Haptophyta：implications for oceanography and chemotaxonomy［J］．Mar Ecol Prog Ser，2004，270：83－102．

［8］ Rodr guez F，Chauton M，Johnsen G，et al．Photoacclimation in phytoplankton：implications for biomass estimates，pigment functionality and chemotaxonomy［J］．Mar Biol，2006，148：963－971．

［9］ Seoane S，Zapata M，Orive E．Growth rates and pigment patterns of haptophytes isolated from estuarine waters［J］．J Sea Res，2009，62：286－294．

［10］ Yao P，Yu Z G，Deng C M．Pigment signatures of some diatoms isolated from China seas［J］．Acta Oceanol Sin，2006，25（1）：108－118．

［11］ Yu Z G，Deng C M，Yao P，et al．Prasinoxanthin－containing Prasinophyceae discovered in Jiaozhou Bay，China［J］．J Integr Plant Biol，2007，49（4）：497－506．

［12］ Yao P，Yu Z G，Deng C M，et al．Spatial－temporal distribution of phytoplankton pigments in relation to nutrient status in Jiaozhou Bay，China［J］．Estuar Coast Shelf Sci，2010，89（3）：234－244．

［13］ 朱卓毅．長江口及鄰近海域低氧現(xiàn)象的探討－以光合色素為出發(fā)點(diǎn)［D］．上海：華東師范大學(xué)，2007．

［14］ 施奈德L R．實(shí)用高效液相色譜法的建立［M］．∥張玉奎等譯．2版．北京：華文出版社，2001：764．

［15］ Mueller J L，F(xiàn)argion G S，McClain C R．Ocean Optics Protocols for Satellite Ocean Color Sensor Validation，Revision 4，Volume V：Biogeochemical and Bio－Optical Measurements and Data Analysis Protocols［R］．NASA／TM－2003－21621／Rev－Vol V，2003，5－14．

［16］ 姚鵬．膠州灣浮游藻的色素分析和基于色素的分類方法研究［D］．青島：中國海洋大學(xué)，2005．

［17］ 鄧春梅．中國近海典型浮游藻特征色素分析和化學(xué)分類方法研究［D］．青島：中國海洋大學(xué)，2008．

［18］ Wright S W，Jeffrey S W，Mantoura R F C，et al．Improved HPLC method for the analysis of chorophylls and carotenoids from marine phytoplankton［J］．Mar Ecol Prog Ser，1991，77：183－196．

Validation of an High Performance Liquid Chromatography（HPLC）Method Using Reversed Phase C8Column for Marine Phytoplankton Pigments

DENG Chun－Mei1，YAO Peng2，YU Zhi－Gang2，Niu Zeng－Yuan3
（1．Key Laboratory of Marine Spill Oil Identification and Damage Assessment Technology，North China Sea Environment Monitoring Centre，State Oceanic Administration，Qingdao 266033，China；2．Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology，Ministry of Education，Department of Chemistry and Chemical Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266100，China；3．Shandong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China）

Validation of an high performance liquid chromatography（HPLC）method for marine phytoplankton pigments was conducted．The HPLC method employs reversed phase C8column，methanol，acetonitrile and acetone as mobile phases and pyridine as solvent modifier to improve the separation of pigment peaks．Good linear relationships between the mass concentrations and the peak areas of 4pigment standards，i．e．chlorophyll a，chlorophyll b，β，β－carotene and lutein were observed in the range of 189．6～18960，89．2～8920，7．77～777．2and 15．28～1528μg／L，respectively．The spiked recoveries were more than 90%for most of the standards exceptβ，β－carotene and the relative standard deviations of multiple determinations were lower than 5%．37pigments were detected in 4reference species and 123water samples from Jiaozhou Bay，and baseline separation of some important biomarker pigments were achieved．The validation results showed that the method was sensitive，accurate and reproducible．It was suitable for the analysis of marine phytoplankton pigments from cultures and field samples with high recoveries．Key words： marine phytoplankton；pigment；high performance liquid chromatography（HPLC）；validation

O657．72；P734．43

A

1672－5174（2011）05Ⅱ－272－07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（40806029，40676068）資助

2011－03－17；

2011－03－24

鄧春梅（1979－），女，高級工程師，博士。E－mail：deng＿cm＠ncsemc．gov．cn

＊＊通訊作者：E－mail：yaopeng＠ouc．edu．cn

責(zé)任編輯 徐 環(huán)