周玲玲,祝建波,王愛英
(石河子大學生命科學學院,石河子832003)
過量表達大葉補血草LgSOS1基因?qū)M南芥耐鹽性的影響
周玲玲,祝建波,王愛英
(石河子大學生命科學學院,石河子832003)
將從鹽生植物大葉補血草(Limonium.gmelinii(Willd.)Kuntze)中分離的質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因Lg SOS1構(gòu)建到p CAMBIA1301植物表達載體的Ca MV35S啟動子下游上,轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因植株。對該植株的PCR和RT-PCR檢測表明,Lg SOS1已整合到擬南芥基因組中并過量表達。對轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性實驗結(jié)果表明:鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株長勢明顯好于對照;鹽分測定表明,轉(zhuǎn)基因植株地上部分的Na+積累顯著低于野生型的,K+含量則顯著高于野生型的。這表明Lg SOS1過量表達提高了擬南芥植株的耐鹽性。
Lg SOS1基因;質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白;擬南芥;耐鹽性
土壤鹽漬化問題是困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一大難題,土壤中高濃度的Na+會擾亂植物正常的代謝活動,影響根細胞對K+的吸收,進而導致細胞生長停止或死亡[1-2]。Na+區(qū)隔化和 Na+外排是植物降低細胞內(nèi)Na+濃度的主要方式,這一生理功能由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白完成[3]。質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋 白 則 參 與 Na+的 外 排[4-5]。Shi等[6-7]研 究 表明,擬南芥質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白At SOS1行使Na+外排功能,并控制Na+長距離運輸。過量表達的遺傳轉(zhuǎn)化體或基因突變體的抗鹽生理結(jié)果表明[8-9],質(zhì)膜型 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白可調(diào)節(jié)植物的耐鹽能力。文獻[10-11]研究結(jié)果表明,水稻和小麥中的質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白也行使類似的功能。
有關(guān)鹽生植物的質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白功能的報道較少[12-13]。我們從泌鹽鹽生植物大葉補血草中克隆了質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因Lg SOS1[14]。
本研究將Lg SOS1導入到擬南芥,獲得過量表達的轉(zhuǎn)基因植株,并分析了鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性,這對進一步了解LgSOS1基因的功能及其與擬南芥耐鹽能力之間的關(guān)系具有一定的參考意義。
1.1.1 植物材料
選用擬南芥(Ar abidopsis thaliana)Colu mbia生態(tài)型,播種于育苗營養(yǎng)土∶蛭石∶珍珠巖為5∶2∶2的混合介質(zhì)中,每3天澆一次自來水,溫度為18~22℃。
1.1.2 質(zhì)粒載體及菌種
質(zhì)粒載體:PCAMBIA1301;
農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens):GV3101菌株為石河子大學農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中心重點實驗室提供。
1.1.3 酶及化學試劑
潮霉素溶液為Sigma公司產(chǎn)品,濃度為50 mg/L;卡那霉素和 Taq酶、A MV、RNAase inhibitor、Trizol試劑均購自上海生物工程公司;其它化學試劑為國產(chǎn)或進口分析純。
1.1.4 儀器設(shè)備
Image Master VDS Pharmacia Biotech凝膠成像系統(tǒng),Eppendorf臺式冷凍離心機(德國Biofuge公司),F(xiàn)CP300型三恒電泳儀(北京六一儀器廠),My Cycler T M thermal cycler PCR儀器(Bio RAD公司)。
1.2.1 植物的生長
擬南芥種子播種于盛滿混合介質(zhì)(草炭土∶蛭石∶珍珠巖=5∶2∶2)直徑7 c m的培養(yǎng)杯中,在16 h光照、8 h黑暗的長日照條件下培養(yǎng),以促進開花。當植株長至莖高約3 c m時,去除其頂生花序,以刺激腋生花序的生長。待腋生花序長出,其下部的花已有授粉現(xiàn)象出現(xiàn)時進行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化前,將已授粉的花及果莢除掉。
1.2.2 菌液制備及滲透操作
挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于20 mL含有40 mg/L利福平、50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,28℃250 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5左右。在轉(zhuǎn)化前1天,以1∶10比例轉(zhuǎn)接到50 mL含抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第2天,當菌液OD600在1.2~1.6之間時取出,室溫5 000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基(蔗糖5%,Sil wet L-77 200μL/L)中,OD600在0.8左右。
將農(nóng)桿菌懸浮液倒在小燒杯中,將長有擬南芥的培養(yǎng)杯倒扣其上,浸泡15 min。取出植株,橫放在塑料盤中,用保鮮膜封好以保持濕度,放在恒溫室培養(yǎng)。第2天打開,豎直培養(yǎng),仍用保鮮膜保持濕度6-7 d。培養(yǎng)3-4周,待種子成熟后,收取種子。
1.2.3 轉(zhuǎn)化植株的篩選
種子消毒:先用70%的乙醇浸泡2 min,再用1%NaCl O溶液渦漩洗滌15 min,無菌水漂洗5次,用0.1%的瓊脂重懸浮種子,均勻分散到固體篩選培養(yǎng)基(1×MS,3%蔗糖,0.8%瓊脂,p H 5.7,潮霉素30 mg/L)表面,放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。大約2周后即可區(qū)分轉(zhuǎn)化植株與未轉(zhuǎn)化植株,將轉(zhuǎn)化植株移栽到土壤中生長以收取種子。
1.2.4 轉(zhuǎn)化植株的遺傳分析
為得到純合的轉(zhuǎn)基因株系,轉(zhuǎn)化植株要自交三代以上。
取T1代所結(jié)種子,表面消毒后播種于含30 mg/L潮霉素的固體篩選培養(yǎng)基上,萌發(fā)2周后統(tǒng)計綠苗和黃苗的分離比例(T1代分離比,單位點插入應(yīng)為3∶1),將綠苗移栽到土壤中,培養(yǎng)至成熟,單株收取種子為T2代種子。
將T2代種子播種于含30 mg/L潮霉素的固體篩選培養(yǎng)基上,其中轉(zhuǎn)基因植株純合子不再發(fā)生分離,這些植株所結(jié)出的T3代種子即為轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)合系,用于耐鹽性實驗。
1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR和RT-PCR鑒定
提取部分轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥的基因組總DNA,分別用 P1(CCTTAGAGGCGTTTGGTGAT)和 P2(AAAATAAGCAACATGATATGGAAGA)這對基因特異性引物進行PCR擴增,并以質(zhì)粒CA MBIA1301-LgSOS1作陽性對照。
為了檢測轉(zhuǎn)化植株中LgSOS1基因是否表達,進行了RT-PCR檢測。
其檢測過程主要如下:采用Trizol RNA提取試劑提取一個轉(zhuǎn)基因的純系和野生型擬南芥的RNA,分別取10μL RNA,2.0μL Oligo d T,70℃5~10 min,冰浴5 min,再加入4μL 5×RT buffer,1.0μL d NTP (10 mmol/L),2.0μL Mg Cl2,0.5 μL RNase Inhibitor,0.5μL A MV 反轉(zhuǎn)錄酶,反應(yīng)體積20μL,37℃1 h;70℃10 min。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板,利用P1、P2引物進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)照相。
1.2.6 鹽脅迫處理
將轉(zhuǎn)基因植株和野生型的種子直接播種于混合介質(zhì)中,用Hoagland營養(yǎng)液定期澆灌。每組3個重復,每個重復包含5棵植株,于8 h光照、16 h黑暗的短日照條件下培養(yǎng),以促進其營養(yǎng)生長。
培養(yǎng)28 d后,分別用0、100、150、200 mmol/L Na Cl處理。Na Cl的濃度逐漸增加,每隔一天處理一次,每次處理增加50 mmol/L,待一起達到處理終濃度后,隔一天再繼續(xù)用終濃度處理7 d,對照澆灌Hoagland營養(yǎng)液。
觀察植株的生長情況,分別取其地上部和根用于干、鮮重及離子含量的測定。
1.2.7 干、鮮重的測量
收取整株植株,用蒸餾水和去離子水將其沖洗干凈,用吸水紙吸干其表面水分,并將其小心分成根和地上部分,測量鮮重。之后放入烘箱中,120℃烘烤30 min,再在80℃烘烤48 h至恒重,稱量干重。
1.2.8 Na+、K+離子含量的測定
將上述烘干至恒重的干材料碾磨成粉末,取一定量的粉末,用8 mL 65%濃硝酸和3 mL 30%雙氧水消解樣品,過濾后定容至50 mL,取部分樣品溶液用i CAP等離子體發(fā)射光譜儀測定K+、Na+含量。
將轉(zhuǎn)基因擬南芥T0、T1、T2、T3代種子在含30 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選,得到轉(zhuǎn)Lg SOS1植株,對其進行了分子鑒定和耐鹽性分析。
以野生型擬南芥的DNA作對照,用Lg SOS1特異性引物P1和P2進行PCR擴增分析,結(jié)果如圖1所示。
由圖1可知:現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株中都可以擴增出大小約為1800 bp左右的目的條帶,與預期的片段大小相吻合,而對照植株沒有出現(xiàn)相應(yīng)的擴增條帶,這表明目的基因的確已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中。
提取經(jīng)PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)化植株及對照植株的總RNA,進一步作RT-PCR鑒定,轉(zhuǎn)化植株中Lg SOS1基因的表達情況見圖2。
圖2顯示:轉(zhuǎn)化植株中Lg SOS1基因已經(jīng)正常轉(zhuǎn)錄,野生型擬南芥沒有出現(xiàn)相應(yīng)的擴增條帶,說明在轉(zhuǎn)化植株中Lg SOS1基因已在轉(zhuǎn)錄水平上得到了表達。
圖1 轉(zhuǎn)LgSOS1植株的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of LgSOS1 in wild type and transgenic plants
圖2 轉(zhuǎn)LgSOS1植株的RT-PCR鑒定Fig.2 RT-PCR identification of LgSOS1 in wild type and transgenic plants
2.4.1 轉(zhuǎn)基因植株在不同鹽脅迫處理條件下的生長情況
分別用不同濃度的Na Cl處理野生型和轉(zhuǎn)基因植株,其生長情況如圖3所示。
由圖3可見:轉(zhuǎn)基因植株在0 mmol/L Na Cl中的生長與野生型植株沒有明顯差異,說明外源基因的插入和表達沒有影響植物正常的生長。在不同濃度NaCl處理下,野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的生長都受到抑制,但轉(zhuǎn)基因植株的長勢明顯好于野生型。
圖3 野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株在0,100,150,200 mmol/L Na Cl處理后的生長比較Fig.3 Comparing the growth of wild type plants and transgenic plants with 0,100,150,200 mmol/L Na Cl treat ment
2.4.2 鹽處理對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株鮮重和干重的影響
結(jié)果見圖4。
由圖4可知:在鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株地上部分和根的鮮重以及干重與野生型植株一樣均下降,當NaCl濃度達150~200 mmol/L時,轉(zhuǎn)基因植株地上部分鮮重顯著高于野生型,而根的鮮重與對照差異未達到顯著水平;在同樣NaCl濃度下,轉(zhuǎn)基因植株地上部分干重與對照差異未達到顯著水平,但根的干重卻顯著高于對照(P<0.05)。
圖4 鹽處理對轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株鮮重和干重的影響Fig.4 Effect of Na Cl treatment on the fresh weight and dry weight of transgenic plants and wild plants
2.4.3 鹽處理對轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株Na+、K+含量的影響
結(jié)果見圖5。
圖5顯示:與0 mmol/L Na Cl處理相比較,在不同濃度NaCl處理條件下,野生型和轉(zhuǎn)基因植株地上部分的Na+含量均有所增加。在100 mmol/L Na Cl條件下,與野生型對照相比,差異不明顯;在150~200 mmol/L Na Cl條件下,轉(zhuǎn)基因植株中Na+含量顯著低于野生型(P<0.05),而野生型和轉(zhuǎn)基因植株的K+含量均有所減少。在不同濃度NaCl處理條件下,轉(zhuǎn)基因植株地上部分的K+含量與對照的差異達到顯著和極顯著水平(200 mmol/L)。
圖5 鹽處理對轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株Na+、K+含量的影響Fig.5 The Na+ (A)、K+ (B)contents of wild type plants and the transgenic plants under different concentration of NaCl treatment
高等植物的排Na+機制主要與質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白有關(guān)[15]。SOD2過量表達的擬南芥在鹽脅迫下降低細胞內(nèi)Na+含量,并顯著增強轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性[16]。Hamada A等從藍藻中克隆了編碼質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因Syn Nhap,明確其在Na+運輸中起重要作用[17]。王姝杰等將藍藻質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因Nhap轉(zhuǎn)入煙草,F(xiàn)1代轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性得到了顯著的提高[18]。
本研究將大葉補血草SOS1基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中進行過量表達后,Na Cl脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的長勢好于野生型,并且轉(zhuǎn)基因植株的鮮重、干重均高于野生型,說明鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株有較強的耐鹽表型,保持了良好的長勢。另外,Na+和K+含量分析表明,150~200 mmol/L Na Cl條件下轉(zhuǎn)基因植株地上部分Na+含量顯著低于野生型(P<0.05),說明在鹽脅迫下SOS1將Na+轉(zhuǎn)運出細胞,與植物的耐鹽性直接相關(guān)。
盡管轉(zhuǎn)基因植株和野生型的K+含量均明顯下降,但轉(zhuǎn)基因植株K+含量下降幅度卻顯著低于野生型。這可能是野生型植株細胞中過多的Na+干擾了細胞對K+的營養(yǎng)吸收,而轉(zhuǎn)基因植株中可能通過催化Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的跨膜運輸將Na+排出細胞外,從而維持細胞內(nèi)低鈉高鉀的生理環(huán)境,發(fā)揮了該基因的耐鹽性。在200 mmol/L NaCl處理條件下,1周后有部分野生型植株出現(xiàn)白化及死亡現(xiàn)象,可能是因為細胞中Na+積累過多,引起了次級氧化脅迫,對植物體造成了過多的傷害,從而引起植株白化死亡。
本研究結(jié)果表明:過量表達Lg SOS1基因的擬南芥比野生型具有較強的耐鹽能力,表明Lg SOS1在鹽脅迫下參與了轉(zhuǎn)基因植株Na+的外排。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白在耐鹽中具有重要作用,隨著編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的發(fā)現(xiàn)及對其作用機制了解的加深,人們將進一步認識Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白功能特征及其信號傳導的調(diào)節(jié)途徑,有望在作物耐鹽的研究方面取得重要突破,在實際生產(chǎn)和應(yīng)用方面真正做出貢獻。
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Influence on Salt Tolerance of Arabidopsis thaliana by Overexpressing LgSOS1
ZHOU Lingling,ZHU Jianbo,WANG Aiying
(College of Life Science,Shihezi University,Shihezi,832003)
The cDNAs of Lg SOS1(Gen Bank aceession No.EU780458),a plasma membrane Na+/H+antiporter gene Lg SOS1 separated from halophyte Limonium gmelinii (Wildl.)Kuntze,were inserted into plant vector pCA MBIA1301.Arabidopsis thaliana wild-type(WT)plants were trans for med with Agrobaterium tumefaciens containing the resultant vectors under the control of Ca MV 35S promoter,and hygro mycin-resistant plants were obtained.PCR analysis indicated that Lg SOS1 gene was integrated into the genome of Arabidopsis.RT-PCR analysis revealed that transgenic plants over-expressed the Lg SOS1 in the transcript levels.Salt stress assay showed that the transgenic plants grew more vigorously than wild-type plants.It was implied by salt contents measure analysis that,compared with WT Plants,Na+accumulation was remarkably lower and the K+level was obviously higher in transgenic plants under severe salt stress(150~200 mol/L NaCl).These results showed that Lg-SOS1-overexpression improved salt tolerance of Arabidopsis transgenic plants.
Lg SOS1 gene;plasma membrane Na+/H+antiporter;Arabidopsis thaliana;salt tolerance
TB332
A
1007-7383(2011)06-0731-06
2011-08-23
國家轉(zhuǎn)基因?qū)m棧?011ZX080052004),石河子大學高層次人才啟動項目(RCZX200903)
周玲玲(1966-),女,副教授,從事植物基因工程研究;e-mail:Linglingzh@shzu.edu.cn。