楊 婧 張海風 王 媛 趙 勤 張新勝 單 杰

(鄭州大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室,河南 鄭州 450001)

癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的一大重要疾病,目前通常采用化療、放療、手術切除等方法進行癌癥的治療。但是癌癥的治療一般都很困難,并且預后不佳〔1〕。血色素氧化酶-1(HO-1)是哺乳動物細胞中廣泛存在的一種可誘導酶,它是血色素在機體內(nèi)被降解過程中的限速酶〔2〕,具有抗氧化,抗凋亡等效應,是細胞內(nèi)重要的保護酶類,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很大關系。有研究表明在大部分癌癥組織里,HO-1蛋白表達變得很高〔3〕,同時機體內(nèi)對抗外界氧化作用的其他酶如超氧化物歧化酶(SOD)、超氧化氫酶 (CAT)等的表達和活效都有或高或低的下降〔4,5〕。這說明 HO-1在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了保護癌細胞的作用。Tet-off調(diào)控系統(tǒng)具有效能高、毒副作用小,并有嚴謹“開關”功能的優(yōu)點,能夠表達連接在其上的目的基因?？赏ㄟ^四環(huán)素類和鹽酸多西環(huán)素〔強力霉素類 (Dox)〕藥物對該系統(tǒng)進行誘導。前期的研究中構建 HO-1的真核表達載體,但該表達載體并不能人為地有效調(diào)控目的基因的表達。本實驗采用 Tet-off調(diào)控表達系統(tǒng)載體,構建一個能夠人為調(diào)控目的基因 HO-1表達的真核表達載體 pB I-EGFP-hHO-1,為后續(xù)實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 限制性核酸內(nèi)切酶 NheⅠ、MluⅠ(Freg Ments公司產(chǎn)品);限制性核酸內(nèi)切酶 HindⅢ、BamHⅠ、Marker DL2000、10×Loading buffer、T4 DNA連接酶、核酸膠回收試劑盒 (TaKa-Ra公司產(chǎn)品);質(zhì)粒小量提取試劑盒 (AxyPrep公司產(chǎn)品);Taq DNA聚合酶、dNTP、lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、TR IZOL Reagent(Invitrogen公司產(chǎn)品);RPM I1640培養(yǎng)粉 (G IBCO公司產(chǎn)品);胰蛋白酶 (Sigma公司產(chǎn)品);小牛血清 (杭州四季青公司);cDNA第一鏈合成試劑盒 (B IORED公司產(chǎn)品);兔抗人HO-1多克隆抗體、兔抗人β-Actin抗體 (SANTA CRUZ產(chǎn)品);S-P免疫組化試劑盒 (中杉金橋生物工程公司);鹽酸多西環(huán)素(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司);質(zhì)粒 pcDNA3.1-hHO-1、質(zhì)粒pB I-EGFP、質(zhì) 粒 pTet-off(由 本 室 保 存);細 菌 菌 株(E.Coli.DH5α)(由本室保存 );人肝癌 (S MMC7721)細胞系(由本室保存)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1的構建 將本室保存的含有質(zhì)粒 pcDNA3.1-hHO-1的 E.Coli.DH5α劃板過夜,挑取單個菌落于 50 mlLB培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒,用 HindⅢ和 BamHⅠ雙酶切得到 HO-1小片段,電泳鑒定為約 800 bp。之后取上述 pcDNA3.1-hHO-1質(zhì)粒作為 PCR擴增模板,在引物中添加 NheⅠ和MluⅠ酶切位點擴增 HO-1片段,電泳后回收。用NheⅠ和 MluⅠ雙酶切 37℃分別處理回收的片段和質(zhì)粒 pB IEGFP,瓊脂糖凝膠電泳后分別膠回收 pB I-EGFP大片段和HO-1小片段。純化后將片段在 T4連接酶作用下進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌。提取重組質(zhì)粒后用 NheⅠ/MluⅠ雙酶切鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細胞 S MMC-7721中的表達

1.2.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 使用含 10%小牛血清的 RPM I1640培養(yǎng)基,將肝癌 S MMC-7721細胞在 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以適當密度接種在 25 ml培養(yǎng)瓶中,待細胞貼壁后密度達到 90%～95%時,使用 lipofectamine2000脂質(zhì)體按照說明書將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進轉(zhuǎn)染組。

1.2.2.2 RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1表達 以適當密度接種在 25 ml培養(yǎng)瓶中,分為三組：①陽性對照即未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組。②轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒 pB I-EGFP、Tet-off組。③轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off組。轉(zhuǎn)染后 48 h分別提取細胞總RNA。使用B IORED公司 cDNA第一鏈合成試劑盒合成 cDNA第一鏈。取上述產(chǎn)物 2μl作為 PCR擴增模板,設計特異性引物擴增 HO-1基因序列中約 110 bp特異片段,同時擴增內(nèi)參對照β-actin片段,2%瓊脂糖凝膠電泳,分析 RT-PCR擴增結果。1.2.2.3 免疫細胞化學鑒定 Tet-off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1的蛋白表達 細胞以適當密度接種在 25 ml培養(yǎng)瓶中,分為四組①未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組,②轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off組。①、②組又分別設立其陰性對照組①-a、②-a(即由 PBS取代第一抗體)。待轉(zhuǎn)染 48 h后,做免疫細胞化學。光電顯微鏡下觀察免疫細胞化學結果。

1.2.3 不同濃度鹽酸多西環(huán)素誘導 Tet-off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1在細胞中的表達 待細胞貼壁,密度達到 90%～95%,將25 ml培養(yǎng)瓶中細胞分別標記為 1～9號,將 Tet-off和 pB I-EGFP-hHO-1共轉(zhuǎn)染進肝癌 S MMC-7721細胞,24 h后分別加入不同濃度的鹽酸多西環(huán)素溶液 ,依次為：1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、3 000 ng/ml。48 h后分別提取細胞總 RNA,同時提取 1瓶未轉(zhuǎn)染細胞作 RT-PCR,2%瓊脂糖凝膠電泳分析結果。

2 結 果

2.1 質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1的構建 NheⅠ/MluⅠ雙酶切重組質(zhì)粒后電泳可見約 5 100 bp及約 866 bp條帶,與質(zhì)粒 pB IEGFP及 HO-1基因序列長度相一致。說明已將質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1構建成功。見圖1。

圖1 重組載體質(zhì)粒 pBI-EGFP-hHO-1酶切鑒定結果

2.2 重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細胞 S MMC-7721中的表達

2.2.1 RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1表達 以βactin mRNA的表達作為內(nèi)參對照,檢測三組 HO-1的 mRNA的表達：①未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對照組;②轉(zhuǎn)染 pB I-EGFP、Tet-off空質(zhì)粒組;③轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off組。結果顯示：以內(nèi)參引物為引物經(jīng) RT-PCR擴增后可見約 427 bp電泳條帶,半定量分析三組細胞中β-actin mRNA表達在凝膠電泳圖條帶亮度上無顯著差異,這說明三組細胞提取的總 RNA量相等。以特異性引物經(jīng) RT-PCR擴增后見到約 110 bp電泳條帶,且③組的 HO-1特異片段的mRNA比①、②組明顯增高?？膳袛嗨沫h(huán)素調(diào)控 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off系統(tǒng)在肝癌細胞 S MMC7721中 HO-1 mRNA的表達增高。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測 HO-1基因 mRNA在SMMC-7721細胞中的表達

2.2.2 免疫細胞化學鑒定 Tet-off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1的蛋白表達 ①-a、②-a細胞上未見棕紅色染色。①、②組細胞均有紅棕色,且②組中一部分細胞紅棕色染色明顯深于①組。說明 Tet-Off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細胞 S MMC7721中 HO-1蛋白質(zhì)的表達增高。見圖3。

2.3 不同濃度鹽酸多西環(huán)素誘導 Tet-off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1在細胞中的表達 檢測 10組 HO-1mRNA的表達。①未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對照組②-⑩分別為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off 24 h后加入 1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、3 000 ng/ml鹽酸多西環(huán)素溶液組。結果顯示：當鹽酸多西環(huán)素溶液濃度達到 2 000 ng/ml時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off組的 HO-1含量接近陰性對照組,即 Tet-off調(diào)控得 pB I-EGFP-hHO-1的鹽酸多西環(huán)素誘導濃度為 2 000 ng/ml。見圖4。

圖3 免疫細胞化學檢測 HO-1蛋白質(zhì)在 SMMC-7721細胞中的表達

1～11：1,5,10,50,100,500,1 000,2 000,3 000 ng/ml多西環(huán)素組 ;未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組;Marker

3 討 論

HO-1在機體遭遇機體氧化或應對外界刺激的時候保護細胞,但恰恰這種保護作用在化學藥物治療或射線放射治療癌癥時,HO-1卻變成了癌細胞的保護酶,使療效降低甚至失去療效。當腫瘤治療達到恢復階段時,化學藥物治療和放射射線治療產(chǎn)生的氧化自由基會繼續(xù)作用于機體的正常健康細胞,如果這些氧化自由基不能及時清除,癌癥患者會恢復緩慢甚至誘發(fā)新的腫瘤,如果在適當?shù)臅r候能夠增強 HO-1的表達,就可以保護正常細胞。鑒于以上種種,本文試圖找到安全有效的方法來調(diào)控 HO-1的表達。

本實驗采用的 Tet-off系統(tǒng),是目前應用最廣泛的誘導性基因表達系統(tǒng),它具有在機體內(nèi)外都能進行基因表達調(diào)控的優(yōu)點〔6〕,可以用于原核生物體,真核生物體模型。其誘導物四環(huán)素類和強力霉素類價格低廉,毒性小,使其正逐漸成為一種較為理想的誘導性基因表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含調(diào)控質(zhì)粒和應答質(zhì)粒,調(diào)控質(zhì)粒 Tet-off,質(zhì)粒中含有一個融合的轉(zhuǎn)錄活化因子結構 tTA,該因子由細菌的四環(huán)素阻遏物 TetR和人類單純皰疹病毒 (HSV)的 VP16轉(zhuǎn)錄激活蛋白融合而成〔7〕,進一步修飾后能被四環(huán)素類及衍生物誘導并激活。應答質(zhì)粒 pB I-EGFP,質(zhì)粒上含有一個 Pbi-1的結構,該結構包含 Tet反應性元件 TRE(包含細菌四環(huán)素操縱子DNA序列 TetO)和人類巨噬細胞立早啟動子 PminCMV-1和 PminCMV-2,PminCMV-1啟動子后有多克隆位點,可以插入外源目的基因,PminCMV-2接有 EGFP綠色熒光蛋白基因〔8〕。當誘導因子 (四環(huán)素類衍生物)不存在時,tTA中 TetR成分和 TetO序列結合,通過 VP16發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性,啟動目的基因及熒光蛋白基因轉(zhuǎn)錄。加入誘導因子后,誘導因子與 tTA結合使其從 TRE上脫落,終止目的基因和熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。從而實現(xiàn)在外源誘導因子的作用下認為的控制目的基因的表達或關閉,并同時有綠色熒光蛋白作為報告基因〔9〕。

有資料表明〔10〕,鹽酸多西環(huán)素的半衰期比四環(huán)素長,即相同劑量的鹽酸多西環(huán)素與四環(huán)素相比能夠在體內(nèi)存在更長的時間,發(fā)揮藥效的時間更長,因此本實驗中選取鹽酸多西環(huán)素作為誘導劑。

在本實驗中 Tet-off作為調(diào)控質(zhì)粒,pB I-EGFP作為應答載體,選用鹽酸多西環(huán)素作為誘導劑。采用定向克隆將 PCR擴增的目的基因 HO-1片段插入到真核表達載體 pB I-EGFP中,將構建好的 pB I-EGFP-hHO-1質(zhì)粒與調(diào)控質(zhì)粒 Tet-off雙轉(zhuǎn)染進肝癌細胞 S MMC-7721中,48 h后檢測 HO-1在 mRNA和蛋白水平的表達情況。采用 RT-PCR方法檢測加入不同濃度的鹽酸多西環(huán)素后,重組質(zhì)粒中 HO-1的表達,得到 Tet-off調(diào)控的 pB IEGFP-hHO-1的鹽酸多西環(huán)素誘導濃度為 2 000 ng/ml。載體構建成功,以及鹽酸多西環(huán)素對該 Tet-off調(diào)控系統(tǒng)誘導濃度的確定,為下一步實驗奠定了基礎。

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