李 慧 石金波劉小翠

（1山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，大同 037009） （2山西省農(nóng)科院高寒區(qū)作物研究所，大同 037008）

·基礎(chǔ)研究·

乳清蛋白的酶法改性研究

李 慧1*石金波2**劉小翠1

（1山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，大同 037009） （2山西省農(nóng)科院高寒區(qū)作物研究所，大同 037008）

采用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶在各自的最適條件下對乳清蛋白粉進(jìn)行水解，通過HPLC方法測定酶解產(chǎn)物中α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）的含量。結(jié)果表明，堿性蛋白酶對其水解最快，其次為木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下則不易酶解，而且發(fā)現(xiàn)α-La比β-Lg更容易水解。

乳清蛋白；α-乳白蛋白；β-乳球蛋白；酶解；高效液相色譜

乳清蛋白（Whey Protein） 是牛奶中的一種主要蛋白質(zhì)，其含量僅次于酪蛋白，占牛奶中蛋白質(zhì)質(zhì)量的18%～20%。其中β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）是乳清蛋白的主要成分，分別占其質(zhì)量的40%～50%和10%～20%左右。乳清蛋白具有較高的營養(yǎng)價(jià)值及功能特性，一直以來被廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)。但乳清蛋白又是一種常見的過敏原，其中β-乳球蛋白是引起牛乳過敏的主要成分，其次為α-乳白蛋白。目前主要通過蛋白質(zhì)改性的方法來控制和消除乳清蛋白過敏原。

蛋白酶催化乳清蛋白水解是降低過敏反應(yīng)的一種有效的方法。蛋白酶通過水解乳清蛋白的抗原決定部位，可以消除或降低其抗原性，降低牛乳過敏反應(yīng)。同時(shí)可以產(chǎn)生一系列具有生物活性的肽，還能改善其功能特性，促使?fàn)I養(yǎng)組成更趨合理、風(fēng)味更為突出。水解產(chǎn)物可作為食品原料或添加輔料應(yīng)用于營養(yǎng)配方食品、保健品、療效食品、臨床營養(yǎng)品、速溶飲品及方便食品，從而拓寬蛋白質(zhì)應(yīng)用范圍，提高蛋白質(zhì)使用價(jià)值，還可滿足消化道蛋白酶分泌不足患者、老年人、運(yùn)動員、肥胖癥患者、嬰兒等特殊人群需要。

本文采用幾種最常用的蛋白酶水解乳清蛋白，通過HPLC方法測定水解產(chǎn)物中α-La和β-Lg含量，以這兩種蛋白的水解速率為指標(biāo)，篩選出最快酶解α-La和β-Lg這兩種過敏原的酶作為最佳用酶，為牛乳蛋白過敏患者尤其是嬰幼兒過敏患者開發(fā)低過敏或無過敏的乳蛋白制品提供方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

乳清蛋白粉（WPC 80），蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72.8%,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.1%，美國Proliant公司；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L），諾維信公司；木瓜蛋白酶 （Papain 18），廣州遠(yuǎn)天；風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme 500MG），諾維信公司；中性蛋白酶，Amresco公司；復(fù)合蛋白酶（Protamex），諾維信公司；胰蛋白酶（trypsin）、胃蛋白酶（pepsin），sigma公司；L-酪氨酸，BDH Chemicals Ltd Poole England。

1.2 儀器與試劑

Sartorious電子分析天平，德國；THZ-82恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；DYCZ-24D雙垂直電泳槽、DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；高效液相色譜儀（SPD-M10AVP），日本島津公司；752紫外光柵分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；792-雙向磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；pHS-25型pH計(jì)，上海精科雷磁。

β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、色譜純乙腈，sigma公司；三氟乙酸，北京津益化工廠。

硼砂、硼酸、氫氧化鈉、乳酸、乳酸鈉、甲醛均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白水解工藝流程

選取堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶7種蛋白酶在各自最適的條件下進(jìn)行水解，水解條件見表1。

表1 水解用酶的最適反應(yīng)條件

稱取一定量的乳清蛋白粉，根據(jù)各種酶的最適pH，選取不同的緩沖液做溶劑配置成質(zhì)量濃度為80 g/L的乳清蛋白粉溶液加入反應(yīng)容器中。達(dá)到酶解溫度后，按照1 000 U/g加入相應(yīng)的酶，在最適條件下水解30 min。反應(yīng)在恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行。反應(yīng)到終點(diǎn)用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH到2，鈍化酶。胃蛋白酶水解終點(diǎn)時(shí)加1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH到12使酶失活。

1.3.2 測定方法

HPLC法測定α-La和β-Lg的條件：Kromasil C8反相色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相為A：體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA水溶液，B：體積分?jǐn)?shù)0.09%的TFA乙腈溶液梯度洗脫。流動相B在10 min內(nèi)從20%上升到50%，然后用10 min從50%上升到80%，在2 min內(nèi)由80%降到20%。流速為0.8 mL/min；二極管陣列檢測器，檢測波長：215 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

水解度的測定采用甲醛滴定法。

蛋白酶活力的測定采用紫外分光光度法。

α-La和β-Lg酶解率計(jì)算方法：

式中：m1——酶解前的含量；

m2——酶解后的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶活力的測定

測得各蛋白酶的活力見表3。酶活是反應(yīng)酶水解底物的能力，本試驗(yàn)對各種蛋白酶的考察均按相同的酶活力加酶，即在相同的條件下考察了各種蛋白酶對α-La和β-Lg的水解能力。

表2 蛋白酶酶活力

2.2 不同蛋白酶水解物中α-La和β-Lg的含量

用HPLC方法分析了各種蛋白酶的酶解產(chǎn)物。圖1為樣品未酶解的HPLC圖譜，圖2是胃蛋白酶的酶解圖譜，其他酶解圖譜略。比較酶解前后的圖譜可以看到，乳清蛋白粉經(jīng)過酶解后，α-La和β-Lg的含量比酶解前降低，而且在α-La和β-Lg的峰前產(chǎn)生許多小峰，說明酶解后產(chǎn)生了大量的肽段。

圖1 樣品的高效液相色譜圖

圖2 胃蛋白酶酶解樣品的高效液相色譜圖

通過HPLC方法測定了各種蛋白酶在其最適條件下酶解后水解物中α-La和β-Lg的含量。經(jīng)過計(jì)算得出其酶解率，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，除胃蛋白酶外，其他6種酶對α-La的酶解率都為100%；而只有堿性蛋白酶將β-Lg徹底酶解，其余均未完全酶解?？芍?La比β-Lg更容易水解。對于β-Lg，堿性蛋白酶對其水解最快，其次為木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下β-Lg不易酶解。因此，本試驗(yàn)選擇堿性蛋白酶為最適用酶，該酶是一種微生物蛋白酶，來源廣泛、活力比較高、水解速度快、成本低，是較理想的工業(yè)用酶。而且該酶為液體酶，容易與底物充分作用。

圖3 不同蛋白酶作用下α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的酶解率

乳清蛋白酶解的速率主要與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，乳清蛋白由于具有二硫鍵，不易被消化酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，乳清蛋白的不易消化性是造成其容易引起過敏的原因。堿性蛋白酶則是內(nèi)肽酶，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺鍵，可水解蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵，生成相對分子質(zhì)量較小的多肽，因而能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的抗原結(jié)合位點(diǎn)，有效降低蛋白的過敏原性。本試驗(yàn)的研究結(jié)論與前人研究結(jié)果一致。Mota等人曾比較了胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶對乳清蛋白粉中β-Lg和α-La的水解速率，結(jié)果表明堿性蛋白酶速率最高。Wroblewska等發(fā)現(xiàn)可以利用堿性蛋白酶水解乳清蛋白，降低乳清蛋白的抗原性，以此來制備低致敏牛奶。沈小琴等人比較了幾種不同酶水解乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶降低乳蛋白抗原性的效果最佳。

2.3 不同蛋白酶水解物的水解度

本試驗(yàn)采用甲醛滴定法測定不同蛋白酶水解物的水解度，結(jié)果見圖4。

圖4 不同蛋白酶水解物的水解度

由圖4可以看出，堿性蛋白酶水解物的水解度最大，表明堿性蛋白酶水解能力最強(qiáng)；其次為木瓜蛋白酶；胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解度最小。以水解能力作為選擇蛋白酶的評價(jià)指標(biāo)時(shí)，應(yīng)選擇堿性蛋白酶，因其水解能力最強(qiáng)，酶的反應(yīng)速度快，能滿足實(shí)際生產(chǎn)的要求。但在采用堿性蛋白酶水解乳清蛋白過程中多采用限制性酶解，即在使α-La和β-Lg水解的前提下，要盡量控制其水解度，主要原因是蛋白質(zhì)充分酶解不僅會使成本增加，而且酶解產(chǎn)物的風(fēng)味變差。蛋白質(zhì)充分酶解后形成的游離氨基酸吸收比多肽的吸收差，而且影響產(chǎn)物的功能特性，使其乳化性及穩(wěn)定性變差。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶7種蛋白酶水解乳清蛋白粉，通過HPLC法定量測定，比較了不同種類的蛋白酶在其最適條件下酶解乳清蛋白后，酶解產(chǎn)物中α-La和β-Lg的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明：α-La比β-Lg更容易水解；7種蛋白酶中堿性蛋白酶對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白水解最快，其次為木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下則不易酶解。最終篩選出堿性蛋白酶作為水解β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的最適用酶。

［1］ MERCIER A，GAUTHIER S F，F(xiàn)LISS I.Immunomodulating effects of whey proteins and their enzymatic digests［J］.International Dairy Journal，2004，14：175-183.

［2］ 管斌，林洪，王廣策.食品蛋白質(zhì)化學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：303.

［3］ KINGHOM N M，NORRIS C S，PATERSON G R.Comparison of capillary electrophoresis with traditional methods to analyse bovine whey proteins［J］.Journal of Chromatography A，1995，700：111-123.

［4］ ENA J M，VAN BERESTEIJN E C H，ROBBEN A J P M，et al.Whey protein antigenicity reduction by fungal proteinases and a pepsin/pancreatic combination ［J］.Journal of Food Science，1995（60）：104-116.

［5］ 趙新淮，馮志彪.蛋白質(zhì)水解物水解度的測定［J］.食品科學(xué)，1994（11）：65-67.

［6］ 姜錫瑞.酶制劑應(yīng)用手冊［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：292-299.

［7］ 鄭海，沈小琴，布冠好，等.堿性蛋白酶水解乳清蛋白過敏原條件的優(yōu)化［J］.中國乳品工業(yè)，2007，35（4）：4-9.

［8］ KANANEN A，SAVOLAINEN J，MAKINEN J，et al.Influence of chemical modifcation of whey protein conformation on hydrolysis with pepsin and trypsin ［J］.International Dairy Journal，2000（10）：691-697.

［9］ 沈小琴，鄭海，羅永康，等.酶解對乳清蛋白抗原性影響的研究［J］.中國乳品工業(yè)，2006，34（6）：12-15.

［10］MOTA M V T，F(xiàn)ERREIRA IMPLVO，OLIVEIRA M B P，et al.Enzymatic Hydrolysis of Whey Protein Concentrat-es：Peptide HPLC Profiles ［J］.Journal of Liquid chromatograohy&related technologies，2004，27（16）：2 625-2 639.

［11］ WROBLEWSKA B，TROSZYNSKA A.Enzymatic hydrolysis of cow’s whey milk proteins in the aspect of their utilization for the production of hypoallergenic formulas［J］. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences，2005，14（4）：349-357.

［12］VAN BERESTEIJIN E C H.PEETERS R A，KAPPER J，et al.Molecular mass distribution，immunological properties and nutritive value of whey protein hydrolysates［J］.J Food Protection，1994，57：619-625.

Study on the enzymatic modification ofwhey protein

LI Hui1*SHI Jin-bo2**LIUXiao-cui1
1（College ofagriculture and life science，Shanxi Datonguniversity，Datong037009，China）2（High latitude crops institute toShanxi academyofagriculture science，Datong037008，China）

Whey protein concentrate（WPC）were hydrolyzed by seven proteases respectively,they were alcalase,papain,flavourzyme,protamex,neturase,pepain and trypsin.The degradation of α-Lactalbumin（α-La）and β-Lactoglobulin（β-Lg）were determined by HPLC.Results indicated alcalase was observed to be the fastest degradation of α-La and β-Lg.The second was papain.Pepain and trypsin hydrolysis rate was slow.α-La hydrolyzed easier than β-Lg.

whey protein； α-Lactalbumin；β-Lactoglobulin；proteolysis；HPLC

TS252.42

A

1673-6004（2011）04-0043-04

*李慧，女，1981年出生，2006年畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)專業(yè)，助理工程師。

**石金波，通訊作者：Email：shijinbo2009@163.com.

2011-07-05