崔大方,羊海軍,趙業(yè)彬,李慶艷,陳考科

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.公共基礎(chǔ)課實驗教學(xué)中心；c.生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

紫花苜蓿復(fù)合體 (Medicagosativacomp lex)是由紫花苜蓿 (M.sativaL.)和與之容易雜交并能產(chǎn)生可育后代的種類共同構(gòu)成的復(fù)合群體,包括紫花苜蓿、黃花苜蓿 (M.falcataL.)以及分布于高加索、中亞細(xì)亞、西伯利亞和中國新疆一帶的天然雜交類群,如天山苜蓿 (M.tianschanicaVassilcz.)、西錫金苜蓿 (M. schischkiniiSum nev.)、伊犁苜 蓿（M.subdicyclaVassilcz.)、密序苜蓿 (M.agropyretorumVassilcz.)、大花苜蓿 (M.trautvetteriiSum nev.)和座墊苜蓿 (M. rivularisV assilcz.)等[1-2],大體包括 3類表型：1)開紫色花,莢果螺旋盤卷；2)開黃色花,莢果鐮狀彎曲或稍直；3)介于前兩者之間,花色多樣,莢果鐮狀彎曲至螺旋盤卷。其中第 3類植物在形態(tài)上有許多重疊,彼此的界限極為模糊,分類學(xué)爭議較大,成為植物分類學(xué)研究的重點(diǎn)。1982年,Sm all等采用 2個元素特征 (Ca和 S)及 12個形態(tài)特征對M.sativa-falcata連續(xù)體進(jìn)行了數(shù)量分析[3]；1984年,Sm all等根據(jù)花色、生長習(xí)性和莢果盤卷圈數(shù)展示了紫花苜蓿、黃花苜蓿和多變苜蓿 (M.variaM artyn)三者之間的連續(xù)性變異特點(diǎn)[4]；Quiros等利用蛋白標(biāo)記,將可能與紫花苜蓿天然雜交的M.falcata、M.cretaceaM.B ieb.、M. varia、M.tunetataM urb.和M.glutinosaM.B ieb.合并稱為紫花苜蓿復(fù)合體[5]；1989年,Sm all等總結(jié)了苜蓿屬(MedicagoL.)的分類進(jìn)展,支持將多變苜蓿和黃花苜蓿劃分為紫花苜蓿的 2個亞種,即M.sativassp.varia(M artyn)A rcang.及M.sativassp.falcata(L.)A rcang.[6]；何詠松等則認(rèn)為紫花苜蓿和黃花苜蓿同屬 1個種的 2個亞種或生物型或生態(tài)型[7]；崔大方等[8]和耿華珠[9]通過葉、花、果、花粉形態(tài)以及染色體核型分析,將黃花苜蓿與紫花苜蓿的天然雜交類群歸并為多變苜蓿,并在多變苜蓿內(nèi)新組合了若干種下分類群；李擁軍等采用種子貯藏蛋白分析技術(shù)和RAPD分子標(biāo)記技術(shù),支持將紫花苜蓿復(fù)合體劃分為3個亞種,即M.sativassp.sativa、M.sativassp.varia和M.sativassp.falcata,并發(fā)現(xiàn)前 2個亞種間的遺傳差異相對較小,而二者與第 3個亞種間的遺傳差異相對較大[10-11]；孫毅等根據(jù)核糖體 DNA的 ITS序列分析結(jié)果將黃花苜蓿與紫花苜蓿并入 1個種[12]。

綜上所述,由于長期以來在不同地理條件下雜交和分離,紫花苜蓿與黃花苜蓿的基因重新組合,出現(xiàn)了許多天然雜交類群,子代和親本類型多樣,這些類群的分類歸屬問題一直未能得到科學(xué)合理的解決。為此,在前期工作的基礎(chǔ)上,作者對紫花苜蓿復(fù)合體的葉部表征形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全面的觀察,并運(yùn)用比較形態(tài)學(xué)、比較解剖學(xué)和數(shù)量分類學(xué)等研究方法對紫花苜蓿復(fù)合體進(jìn)行比較分析,為解決紫花苜蓿復(fù)合體中各分類群的分類歸屬問題提供研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試紫花苜蓿復(fù)合體分類群的具體信息見表 1,憑證標(biāo)本保存于新疆師范大學(xué)植物標(biāo)本室(XJNU)。

1.2 方法

1.2.1 葉表皮顯微特征的觀察方法 選取標(biāo)本上部完好的成熟葉片,在小葉中部中脈附近剪取 0.5 cm×0.5 cm的小片,浸泡在V(體積分?jǐn)?shù) 30％過氧化氫)∶V(乙酸)=1∶1的混合溶液中；60℃溫箱中靜置 3～5h后,用蒸餾水沖洗干凈；剝?nèi)∪~表皮,用體積分?jǐn)?shù)10％過氧化氫溶液漂白 5～10m in,再用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 1％番紅溶液染色 20～30 m in,然后用體積分?jǐn)?shù)1％的甘油封片。在 DMLB型顯微鏡 (德國萊卡公司生產(chǎn))下觀察并照相。氣孔密度為 15個觀察視野的平均值。

表 1 供試紫花苜蓿復(fù)合體各分類群的憑證標(biāo)本信息Tab le 1 In form a tion of voucher spec im en s of tested taxa in M ed icago sa tiva com p lex

1.2.2 葉表皮亞顯微特征的觀察方法 選取標(biāo)本上部完好的成熟葉片,經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 10％過氧化氫溶液漂白 5～10m in,用純凈水洗凈,再用體積分?jǐn)?shù) 30％～100％的乙醇進(jìn)行梯度脫水,用雙面膠將葉片固定在樣品臺上鍍膜噴金后,用 XL-30-ESEM型環(huán)境掃描電鏡(荷蘭菲利普公司生產(chǎn))觀察并照相。

1.2.3 葉片組織結(jié)構(gòu)的觀察方法 采用石蠟切片法觀察葉片的解剖結(jié)構(gòu)特征。從葉片中部至邊緣切取面積 0.5 cm×0.5 cm的小片(包含中脈),用 FAA溶液固定后,用體積分?jǐn)?shù) 50％～100％的乙醇進(jìn)行梯度脫水,然后用二甲苯透明處理,并用石蠟包埋后切片,切片厚度 8～10μm,番紅 -固綠對染,中性樹膠封片。在DMLB型顯微鏡下觀察、測量并照相。其中,葉片、柵欄組織和海綿組織厚度各測量 30個數(shù)值,計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差以及組織疏松度和緊縮度。疏松度 =(海綿組織厚度/葉片厚度)×100％；緊縮度 = (柵欄組織厚度/葉片厚度)×100％。

1.2.4 分類群的表征分析方法 基于表征形態(tài)數(shù)據(jù)分別計算相關(guān)系數(shù)和平均歐氏距離,并采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析,然后選擇最優(yōu)者應(yīng)用結(jié)合線法進(jìn)行類群劃分[13]；采用主成分分析法探討紫花苜蓿復(fù)合體葉部特征的分類學(xué)價值。

用于聚類分析的葉片形態(tài)表征性狀包括 6個數(shù)量性狀及 9個定性性狀。數(shù)量性狀為上表皮氣孔密度、下表皮氣孔密度、葉片厚度、柵欄組織層數(shù)、組織疏松度、組織緊縮度。定性性狀及其賦值為：上表皮細(xì)胞形狀(不規(guī)則形 0,不規(guī)則形或多邊形 1)；上表皮細(xì)胞長短軸分化程度 (多數(shù)明顯 0,明顯或不明顯 1,少數(shù)明顯 2)；上表皮細(xì)胞垂周壁式樣(深波狀 0,波狀至淺波狀 1,平直或弓形 2,其他 3)；下表皮細(xì)胞形狀(不規(guī)則形 0,不規(guī)則形或多邊形 1)；下表皮細(xì)胞長短軸分化程度(多數(shù)明顯 0,明顯或不明顯 1,少數(shù)明顯2)；下表皮細(xì)胞垂周壁式樣 (深波狀 0,波狀至淺波狀1,平直或弓形 2)；表皮細(xì)胞切面形狀(近長方形 0,近長方形或近圓形 1,近圓形 2)；柵欄組織細(xì)胞排列狀況(緊密 0,較緊密 1,較疏松 2,疏松 3)；海綿組織細(xì)胞排列狀況(疏松 0,較疏松 1,較緊密 2,緊密 3)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理全部使用生物統(tǒng)計“NTSYS-PC”軟件包完成。對所采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,將原來的性狀作為運(yùn)算單位,計算相似性系數(shù)并組成相似性系數(shù)矩陣,所得矩陣用NTSYS-PC version 2.1e進(jìn)行處理。

聚類分析程序為：將原始矩陣用 Standardization子程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,然后用 Sim ilarity子程序中的Interval data求出歐氏距離矩陣,再用 C lustering程序中的 Shani子程序以UPGMA方法進(jìn)行聚類。

主成分分析程序為：將原始矩陣用 Standardization子程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,然后用 Sim ilarity子程序中的Interval data求出各變量的相關(guān)系數(shù),再用 O rdination中的 Eigen子程序算出特征值和特征向量等。

2 結(jié)果和分析

2.1 掃描電鏡下紫花苜蓿復(fù)合體各分類群的葉表皮亞顯微特征

紫花苜蓿復(fù)合體 6個分類群葉表皮亞顯微特征的觀察結(jié)果見圖版Ⅰ-1～6。紫花苜蓿、西錫金苜蓿、座墊苜蓿和天山苜蓿的下表皮細(xì)胞均為不規(guī)則形(圖版Ⅰ-1,3,4,6)；黃花苜蓿和大花苜蓿的下表皮細(xì)胞多數(shù)為不規(guī)則形,少數(shù)呈多邊形(圖版Ⅰ-2,5)。根據(jù)波狀起伏程度,不規(guī)則形細(xì)胞的垂周壁式樣分為深波狀、波狀和淺波狀；多邊形細(xì)胞的垂周壁式樣有平直和弓形。根據(jù)細(xì)胞表面隆起程度,可分為 3類： 1)紫花苜蓿、西錫金苜蓿、天山苜蓿的細(xì)胞表面向上隆起呈山丘狀,后者稍不明顯；2)黃花苜蓿和座墊苜蓿的細(xì)胞表面平整或近平整；3)大花苜蓿的細(xì)胞表面近平整或向下凹陷。各分類群的下表皮都被有稀疏表皮毛和氣孔器。表皮毛均為單細(xì)胞非腺毛,基部膨大,先端銳尖,毛上有微小乳突。所有分類群的氣孔器均由氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞組成,并被 3～5個表皮細(xì)胞所包圍,屬不規(guī)則型氣孔器,并具有蠟質(zhì)氣孔蓋。

2.2 光學(xué)顯微鏡下紫花苜蓿復(fù)合體各分類群的葉片表皮形態(tài)特征

在光學(xué)顯微鏡下,紫花苜蓿復(fù)合體各分類群葉片上、下表皮的細(xì)胞形狀、長短軸分化程度、垂周壁式樣、氣孔器類型及氣孔密度的觀察和統(tǒng)計結(jié)果見圖版Ⅰ-7～12和表 2。光學(xué)顯微鏡下這 6個分類群葉表皮的形態(tài)特征(圖版Ⅰ-7～12)與掃描電鏡觀察結(jié)果基本相似。除黃花苜蓿的上、下表皮細(xì)胞有少量呈多邊形、多數(shù)呈不規(guī)則形外,其余分類群葉表皮細(xì)胞均為不規(guī)則形；大部分分類群的葉表皮細(xì)胞長短軸明顯；垂周壁呈波狀,但有深淺之分,其中黃花苜蓿上、下表皮細(xì)胞的垂周壁盡管也為波狀至淺波狀,但也有垂周壁呈平直或弓形,與其他分類群有所不同；6個分類群葉表皮氣孔器均屬不規(guī)則型,上、下表皮均有氣孔,且上表皮氣孔密度大于下表皮 (天山苜蓿除外),其中黃花苜蓿葉片上、下表皮的氣孔密度均最大,分別為 237和 188mm-2。

表 2 光學(xué)顯微鏡下紫花苜蓿復(fù)合體不同分類群葉表皮形態(tài)特征的觀察結(jié)果Tab le 2 O bserva tion resu lt ofm orpholog ica l characters of lea f ep iderm is of d ifferen t taxa in M ed icago sa tiva com p lex by LM

2.3 紫花苜蓿復(fù)合體各分類群的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征

供試的紫花苜蓿復(fù)合體 6個分類群的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征見表 3和圖版Ⅱ。6個紫花苜蓿復(fù)合體分類群的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征相似：葉片均為薄紙質(zhì)型,厚度相差不大,為 130～170μm；上、下表皮細(xì)胞切面觀為近圓形或近長方形。柵欄組織具有 1～2層細(xì)胞,厚度為 41～68μm；通?？拷砥さ牡?1層?xùn)艡诮M織細(xì)胞呈長圓柱狀,排列相對緊密；第 2層?xùn)艡诮M織細(xì)胞呈短圓柱狀,排列較第 1層相對疏松。海綿組織厚度差別較大,為 32～75μm,細(xì)胞排列較疏松。

表 3顯示,紫花苜蓿復(fù)合體 6個分類群葉片細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的差異較明顯,其中組織疏松度最大的為大花苜蓿(57.46％),最小的為紫花苜蓿 (24.85％),前者是后者的 2.31倍；組織緊縮度最大的為紫花苜蓿(51.70％),最小的為大花苜蓿 (31.56％),前者是后者的 1.64倍。

表 3 紫花苜蓿復(fù)合體不同分類群葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的觀察結(jié)果1)Tab le 3 O bserva tion resu lt of leaf ana tom ica l structure fea tures of d ifferen t taxa in M ed icago sa tiva com p lex1)

2.4 基于紫花苜蓿復(fù)合體各分類群葉片表征形態(tài)性狀的聚類分析結(jié)果

基于 15個葉片表征形態(tài)性狀的紫花苜蓿復(fù)合體各分類群的UPGMA聚類分析結(jié)果見圖 1。應(yīng)用結(jié)合線法[13]劃分類群時,在結(jié)合過程中,前 4次結(jié)合水平變化平緩,而第 5次結(jié)合水平迅速提高,產(chǎn)生了 1次飛躍。如果取飛躍前后 2次結(jié)合水平的平均值 1.53 (歐氏距離)作為劃分類群的標(biāo)準(zhǔn),則可得到 2支,其中黃花苜蓿獨(dú)立為一支,其余 5個分類群聚成另一支。此處的結(jié)合水平可以作為種的界線。從劃分結(jié)果看,中國境內(nèi)的紫花苜蓿復(fù)合體應(yīng)包含 2個種,即黃花苜蓿和紫花苜蓿。當(dāng)結(jié)合水平取1.18(歐氏距離)時,第 2支又被分成 2個亞支,其中一個亞支包含紫花苜蓿和天山苜蓿,另一個亞支則包括西錫金苜蓿、座墊苜蓿和大花苜蓿,由此可以看出它們的相似性程度極高,且與紫花苜蓿的距離更近。

圖1 紫花苜蓿復(fù)合體不同分類群的 UPGM A聚類分析結(jié)果F ig.1 C luster ana lysis resu lt of UPGM A of d ifferen t taxa in M ed icago sa tiva com p lex

2.5 基于紫花苜蓿復(fù)合體各分類群葉片表征形態(tài)性狀的主成分分析結(jié)果

基于 15個葉片表征形態(tài)性狀的紫花苜蓿復(fù)合體各分類群的主成分分析 Q分布圖見圖 2,結(jié)果顯示,主成分分析Q分布圖的結(jié)果與基于歐氏距離進(jìn)行的聚類分析結(jié)果有較高的一致性。

圖 2 紫花苜蓿復(fù)合體不同分類群主成分分析的 Q分布圖F ig.2 Q d istr ibution m ap of pr incipa l com ponen t ana lysis of d ifferen t taxa in M ed icago sa tiva com p lex

主成分分析結(jié)果 (表4)表明,前3個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá) 85.14％,足以代表全部性狀所提供的信息。第 1主成分的貢獻(xiàn)率達(dá) 53.55％,是認(rèn)識紫花苜蓿復(fù)合體的主要方面,各性狀的絕對權(quán)重值主要是表皮細(xì)胞形狀、垂周壁式樣和氣孔密度的差異性反映,實際情況有 2種不同的傾向：一種表現(xiàn)為表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則、垂周壁波狀至深波狀、氣孔密度較小；另一種表現(xiàn)為部分表皮細(xì)胞規(guī)則、垂周壁淺波狀至平直、氣孔密度較大。第 2主成分的貢獻(xiàn)率為 19.13％,主要反映了葉片內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的致密性。第 3主成分的貢獻(xiàn)率為 12.46％,主要反映了表皮細(xì)胞的軸性分化特征。因此,對于紫花苜蓿復(fù)合體各分類群而言,葉片的表皮細(xì)胞形狀、垂周壁式樣、軸性分化特征、組織疏松度和氣孔密度等性狀具有較好的分類價值。

表 4 紫花苜蓿復(fù)合體葉部特征的主成分分析結(jié)果1)Tab le 4 Resu lt of pr incipa l com ponen tana lysisof leaf character istics of M ed icago sa tiva com p lex1)

3 討論和結(jié)論

中國境內(nèi)的紫花苜蓿復(fù)合體在組成上相對簡單,《中國植物志》記載該復(fù)合體包括 3種 1變種[14],而文獻(xiàn)[9]記載該復(fù)合體包括 3種 2變種 6變型,這兩種處理結(jié)果都將多變苜蓿置于種的層面上,只是后者又從中劃分出多個變型。分類學(xué)家大都認(rèn)為多變苜蓿是Medicagosativa和M.falcata的雜交產(chǎn)物,具有較為完整的形態(tài)漸變,因而分類困難。就本文涉及的多變苜蓿的次級分類群而言,前蘇聯(lián)的有關(guān)植物志[1-2]常將該種處理成許多種,如：將分布于高加索、中亞細(xì)亞、西伯利亞和中國新疆一帶的相關(guān)天然雜交類群 分 成M.schischkinii、M.tianschanica、M. agropyretorum、M.subdicycla、M.trautvetterii和M. rivularis等。歐美學(xué)者習(xí)慣傾向于生物學(xué)種,允許較大的形態(tài)變異尺度,故將這些變異類型都?xì)w入多變苜蓿,并做為異名處理[15],由他們確認(rèn)的紫花苜蓿復(fù)合體不僅包括M.sativassp.×varia(M artyn)A rcang.,甚至將黃花苜?！睲.sativassp.falcata(L.)A rcang.〕也囊括其中。相比之下,中國學(xué)者的處理意見比較折中。作者基于紫花苜蓿復(fù)合體不同分類群的葉部特征、應(yīng)用聚類分析和結(jié)合線法劃分的分類結(jié)果與傳統(tǒng)的分類結(jié)果有所差別。結(jié)合水平取 1.53,可得到 2個分支,即黃花苜蓿和以紫花苜蓿為代表的一支,進(jìn)一步的劃分結(jié)果表明紫花苜蓿是一個多型種。這 2個分支的性別親和能力強(qiáng),基因交流容易,并且雜交后代的生活力絲毫沒有削弱的跡象,如果僅從性別親和力上考慮,理所當(dāng)然可以認(rèn)為它們是同一種。但是,高等植物間的性別隔離遠(yuǎn)沒有動物那樣嚴(yán)格,并且在形態(tài)上 2個分支的差異又極為顯著,因此作者認(rèn)為將它們處理為 2個不同的種可能更加妥當(dāng)。

因表型變異幅度極大,多變苜蓿的歸屬問題一直是分類學(xué)上的難題。從聚類分析的樹系圖看,多變苜蓿(本文中供試的為其異名的西錫金苜蓿、座墊苜蓿、天山苜蓿和大花苜蓿)與紫花苜蓿歸在一類,說明多變苜蓿與紫花苜蓿的相似性水平較之與黃花苜蓿明顯要高,這與李擁軍等[10-11]的研究結(jié)果一致,但它們在形態(tài)特征上仍然存在一定的差異,這一點(diǎn)與《中國植物志》上的分類處理是一致的,所以,作者認(rèn)為將多變苜蓿處理為獨(dú)立的種有一定的合理性。

綜上所述,作者認(rèn)為多變苜蓿起源于黃花苜蓿和紫花苜蓿的雜交,葉部形態(tài)特征更接近于紫花苜蓿。國產(chǎn)的紫花苜蓿復(fù)合體包含 3個分類群,即紫花苜蓿、黃花苜蓿及多變苜蓿。從葉片的形態(tài)特征聚類分析結(jié)果看,前蘇聯(lián)學(xué)者曾作為種級單位命名的一些雜交后代分類群(如西錫金苜蓿、座墊苜蓿、天山苜蓿和大花苜蓿等)的性狀分化不穩(wěn)定,它們都應(yīng)屬于多變苜蓿的同種異名植物。

基于不同相似性系數(shù)所得到的聚類分析結(jié)果存在差別,而基于歐氏距離的聚類分析結(jié)果與主成分分析中的Q分析結(jié)果較吻合,因而,根據(jù)歐氏距離進(jìn)行的聚類分析結(jié)果更加可靠,可作為劃分紫花苜蓿復(fù)合體分類群的基礎(chǔ)。

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