尹明銳,汪 蘋,劉健楠,王 磊,李?yuàn)W博

北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048

具有 N2O控逸能力的異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌株的篩選鑒定

尹明銳,汪 蘋＊,劉健楠,王 磊,李?yuàn)W博

北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048

利用 BTB平板培養(yǎng)基以及硝化 -反硝化性能測(cè)定,從實(shí)驗(yàn)室馴化成熟的 SBR反應(yīng)器中篩選出 3株異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌.其中W YLW 1-6菌株的硝化 -反硝化性能尤為突出,經(jīng) 16S rDNA基因序列分析和 B iolog測(cè)定,該菌株屬于蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus).在搖瓶培養(yǎng)時(shí),對(duì)該菌株設(shè)計(jì) L4(23)的正交試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌株W YLW 1-6投加到水中后啟動(dòng)迅速,且生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng),優(yōu)選條件下,其氨氮最大去除率可達(dá) 95.21%.用發(fā)酵罐對(duì)其擴(kuò)大培養(yǎng)測(cè)定 N2O逸出量,表明該菌脫氮效果良好,NH4

+-N去除率達(dá)到 97.19%,TN去除率為 96.63%,N2O逸出量為 1.849 2m g,其中 N2O-N量為 1.176 8m g,N2O-N量占水中脫除 TN量的 0.598%.菌株W YLW 1-6能夠獨(dú)立完成生物脫氮的全過程,高效脫氮的同時(shí) N2O逸出量低.該菌可用于構(gòu)建一個(gè)低N2O逸出的高效脫氮菌系,從而實(shí)現(xiàn)N2O生物控逸.

蠟狀芽孢桿菌;異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化;發(fā)酵罐;N2O生物控逸

N2O是主要溫室氣體,同時(shí)又能破壞臭氧層.研究發(fā)現(xiàn),在廢水脫氮過程中有害氣體產(chǎn)物 N2O占總脫氮量的 30%～50%[1].廢水脫氮過程中影響 N2O逸出的因素包括外在因素 (環(huán)境因素)和內(nèi)在因素(菌種和酶特性).近年來,關(guān)于 N2O逸出多集中于環(huán)境因素 (如 DO,pH,溫度,鹽度等)的研究,如劉秀紅等[2]發(fā)現(xiàn)在生活污水脫氮過程中有 N2O產(chǎn)生,且主要產(chǎn)生于硝化階段,而反硝化作用有利于降低N2O逸出量.PARK等[3]研究表明,低的ρ(DO)(0.2～0.5m g/L)和較高的ρ(NO2--N)可促使 N2O逸出.以上研究基本是通過調(diào)整工藝參數(shù)來提高脫氮菌群中氧化亞氮還原酶的活性,以達(dá)到實(shí)現(xiàn)控制N2O排放的目的.但工藝控逸不能解決某些菌株根本缺乏氧化亞氮還原酶的問題,即不能從根本上解決N2O能否被還原的問題,因此通過改變工藝條件,而改善N2O逸出的比例十分有限.一般改善后的N2O占從水體中脫除氮量的 10%～30%,而內(nèi)在因素 (菌種和酶特性)才是導(dǎo)致 N2O逸出的根本原因,因此只有篩選出能夠降低 N2O逸出量的菌株才是實(shí)現(xiàn) N2O生物控逸的根本途徑,但目前鮮見有關(guān)N2O生物控逸菌株報(bào)道.

傳統(tǒng)生物脫氮包括好氧硝化和缺氧反硝化 2個(gè)過程.近年來研究[4-5]發(fā)現(xiàn),在好氧條件下也可以進(jìn)行反硝化,而且這些好氧反硝化菌往往也能進(jìn)行異養(yǎng)硝化作用.這些菌可以在有氧條件下直接把氨氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物而去除.這些菌種具有硝化和反硝化的雙重功能,而且生成的 N2O也比自養(yǎng)菌少得多[4-5],從理論上進(jìn)一步為同步硝化 -反硝化現(xiàn)象提供了微生物學(xué)的依據(jù).異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化已逐漸成為研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)[6-7],但對(duì)具有異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化功能菌的 N2O控逸報(bào)道不多[8-9].筆者從 SBR反應(yīng)器活性污泥中篩選出兼具異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化性能的菌株,并研究其 N2O逸出情況.

1 材料與方法

1.1 菌源

菌株取自于以硝酸鹽為底物,高溶解氧條件馴化下的 SBR反應(yīng)器的活性污泥,該反應(yīng)器的總無機(jī)氮 (TIN)去除率為 80%～85%,CODCr去除率為85%～90%.

1.2 培養(yǎng)基

BTB培養(yǎng)基：瓊脂 20 g/L,KNO31 g/L,KH2PO41 g/L,FeC l2·6H2O 0.5 g/L,CaC l2·7H2O 0.2 g/L,M gSO4·7H2O 1 g/L,琥珀酸鈉 8.5 g/L,BTB 1 m L,調(diào) pH至 7.0～7.3.

反硝化富集培養(yǎng)基 (LB)：檸檬酸三鈉 4.2 g/L,KNO31.0 g/L,KH2PO41.0 g/L,FeC l2·6H2O 0.5 g/L,CaC l2·7H2O 0.2 g/L,M gSO4·7H2O 1.0 g/L.

反硝化培養(yǎng)基 (DM)：檸檬酸三鈉 3.06 g/L,KNO30.722 g/L,KH2PO41.0 g/L,M gSO4·7H2O 1.0 g/L.

硝化富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.47 g/L,KH2PO41 g/L,FeC l2·6H2O 1.25 g/L,CaC l2·7H2O 0.2 g/L,M gSO4·7H2O 1 g/L,碳源用量依據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)ρ(CODCr)/ρ(N)調(diào)節(jié).

硝化培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.47 g/L,碳源用量依據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)ρ(CODCr)/ρ(N)及碳源種類調(diào)節(jié),維氏鹽溶液 50m L.

維氏鹽溶液：K2HPO45.0 g/L,FeSO4·7H2O 0.05 g/L,NaC l 2.5 g/L,M gSO4·7H2O 2.5 g/L,M nSO4·4H2O 0.05 g/L.

1.3 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的分離篩選

1.3.1 好氧反硝化菌株的分離

BTB培養(yǎng)基是 TAKAYA等[10]提出的用于好氧反硝化菌分離的培養(yǎng)基,由于反硝化過程對(duì)硝酸的消耗,表現(xiàn)為培養(yǎng)液 pH的上升,培養(yǎng)基中所含的指示劑 BTB能夠準(zhǔn)確地指示這一變化.如果接種后培養(yǎng)基平板出現(xiàn)由于 pH增加引起的藍(lán)色暈圈或菌落,可以初步確定為好氧反硝化菌株.

采用梯度稀釋及涂布法將 SBR反應(yīng)器中的混合液均勻涂布于 BTB培養(yǎng)基,30℃恒溫培養(yǎng)數(shù)天后,挑取周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)色的暈圈,且菌落形態(tài)不相同的單菌落作為初篩菌,在平板上劃線進(jìn)行菌株的純化.劃線篩選得到的純菌株在試管中劃斜面保存.

1.3.2 好氧反硝化菌株的優(yōu)選

將分離得到的好氧反硝化菌進(jìn)行反硝化性能的測(cè)定,以其 NO3--N去除率和 TN去除率為指標(biāo),來優(yōu)選好氧反硝化菌株.試驗(yàn)在搖瓶中進(jìn)行,以檸檬酸三鈉為唯一碳源,以硝酸鉀為唯一氮源,初始ρ(NO3

--N)約為100 m g/L,ρ(CODCr)/ρ(N)為15,pH為 7.0,120 r/m in,30℃的條件下進(jìn)行測(cè)定.

將菌株接種到 LB培養(yǎng)基中,在氣浴恒溫?fù)u床中培養(yǎng) 12～16 h,然后按 5%的接種量接種至已滅菌過的裝有 200m L DM培養(yǎng)基的搖瓶中,為防止瓶中空氣與外界氣體的交換,以封口膜封口.培養(yǎng) 4 d后,取樣測(cè)定 A600,然后將樣品在8 000 r/m in下離心分離 10 m in,取上清液分析 ρ(NO3--N),ρ(NO2

--N)和ρ(CODCr).

1.3.3 異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌株的分離

將篩選得到的高效好氧反硝化菌株接種到硝化富集培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基置于搖瓶中,30℃,120 r/m in搖床培養(yǎng) 12～16 h,能夠保證ρ(DO)為 4.90～6.01 m g/L.再將富集液接種于異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng) 4 d,測(cè)定ρ(NH4+-N),ρ(NO3和ρ(CODCr).以其 NH4+-N去除率和 TN去除率為指標(biāo),選取 NH4+-N去除率大于 50%的菌株作為具有異養(yǎng)硝化功能的菌株,此時(shí)即認(rèn)為該菌株兼具異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化性能,從而確認(rèn)分離出異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌株.

1.3.4 異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌株的優(yōu)選

對(duì)篩選出的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株設(shè)計(jì)三因素兩水平L4(23)的正交試驗(yàn)來優(yōu)選其培養(yǎng)條件,試驗(yàn)在搖瓶中進(jìn)行,培養(yǎng)過程中每隔 24 h取樣,先測(cè) A600,然后將樣品在8 000 r/m in下離心分離 10 m in,取 上 清 液 分 析 ρ(NH4+-N),ρ(NO3

1.3.5 發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)

“篩選優(yōu)勢(shì)菌種構(gòu)建同步硝化 -反硝化”是近年來提出的觀點(diǎn),它為實(shí)現(xiàn) N2O生物控逸開辟了新途徑.發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)是為了方便進(jìn)行脫氮產(chǎn)物N2O的測(cè)定.使用 M inifors(瑞士)小型臺(tái)式發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),該發(fā)酵罐能夠精確穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)攪拌速度,溫度,pH,ρ(DO),消泡和液位控制,附件氧氣控制及氣體混合控制.pH,ρ(DO)和溫度在整個(gè)培養(yǎng)過程均為在線自動(dòng)控制.試驗(yàn)條件：琥珀酸鈉,ρ(CODCr)/ρ(N)為20,初始ρ(NH4+-N)為80m g/L,30℃,120 r/m in,曝氣流量 1 L/m in,培養(yǎng)周期 58 h,取樣時(shí)間間隔 2 h.將異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基以 2.5 L的裝液量灌至 5 L的M inifors發(fā)酵罐中.整體經(jīng) 0.1M Pa下滅菌 30m in后,冷卻至30℃,將過夜培養(yǎng) 16 h左右的菌懸液以 5%的接種量接種至發(fā)酵罐內(nèi).在30℃,120 r/m in,pH為 9.0的條件下擴(kuò)大培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中曝氣量穩(wěn)定在 1 L/m in.每隔一定時(shí)間抽取 10 m L液體樣品,跟蹤測(cè)定ρ(NH4+-N),ρ(NO3--N),ρ(NO2--N),A600和ρ(CODCr)5項(xiàng)指標(biāo)隨時(shí)間的變化.同時(shí)在排氣口收集氣體,對(duì)其進(jìn)行N2O的測(cè)定.

1.4 分析方法

1.4.1 水體中各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定[11]ρ(NH4+-N)采用納氏試劑分光光度法測(cè)定;ρ(NO2--N)采用 N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定;ρ(NO3--N)采用紫外分光光度法測(cè)定;菌體生長(zhǎng)量采用比濁法測(cè)定,用 721可見分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)吸光度值 (A600);ρ(CODCr)采用蘭州連華 5B-1型 COD速測(cè)儀測(cè)定.

1.4.2 菌株 16S rDNA基因序列測(cè)定及 B iolog自動(dòng)化微生物鑒定

菌株的 RNA提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 (天根生物科技有限公司).16S rDNA基因擴(kuò)增引物采用通用引物,正向引物為 27 f(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′);反 向 引 物 為1492 r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTTC-3′),由英俊生物科技有限公司合成.

PCR反應(yīng)體系 (50μL)：10×PCR Buffer(含 15 mmo l/LM gC l)5μL,dNTPs 4μL,引物 27 f和 1492 r各 2.5μL,雙重蒸餾水 34μL,混勻后加入 DNA模板 2.5μL,Taq酶 0.5μL.PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4m in;94℃變性 30 s,52℃退火 80 s,72℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán)后;72℃延伸 8 m in.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析,由天根生物科技有限公司測(cè)序[12].將菌株的 16S rDNA序列在 GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比較.

B io log自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)利用微生物對(duì) 95種不同碳源的代謝情況來鑒定菌種,即各種菌形成各自特有的代謝指紋圖譜,在培養(yǎng) 24 h后將其置于B io log讀數(shù)儀上與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,讀取結(jié)果[13].

1.4.3 氣體 N2O的測(cè)定

測(cè)定條件：檢測(cè)器溫度 (TD)350℃,分離柱溫度 (TC)50℃,載氣流速 (fC)20mL/m in.在該條件〔相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (CV)=1.05%〕下經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定,氣袋能基本滿足短期N2O氣體樣品的保存,可用于現(xiàn)場(chǎng)取樣近期分析.

采用 GC-ECD法測(cè)定過程中 N2O產(chǎn)出量[14],每隔 0.5 h在發(fā)酵罐排氣口處用 100mL玻璃注射器緩慢勻速抽取氣體,并立即注入事先用高純氮清洗過并抽成真空的 500mL氣袋中,待測(cè).測(cè)定時(shí)用10mL氣體樣品鎖式進(jìn)樣器從氣袋中準(zhǔn)確抽取一定量氣體進(jìn)行 GC-ECD分析.采用 Varian 3800氣相色譜儀;10m ci63N i電子捕獲檢測(cè)器 (ECD);3m×3 mm不銹鋼柱,采用 2根 Po rapak Q(80～100目,孔徑為 0.15～0.18mm)填充柱,一根為 1 m ×2 mm的前置柱,另一根為 3m×2mm的分析柱.

試驗(yàn)中對(duì)倒手抽取氣體的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證：用注射器抽取ρ(N2O)為 17.69 m g/m3的標(biāo)準(zhǔn)氣體100mL注入氣袋中,再抽出注射到分析儀器中,連續(xù)測(cè)定 3次,3次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值為 17.31 m g/m3,圖 1為試驗(yàn)中用到的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性系數(shù)為0.999 3.

N2O逸出量為氣相中N2O含量和溶于水體中的N2O含量之和.采用圖解積分的方法對(duì)系統(tǒng)的氣相中N2O逸出量進(jìn)行計(jì)算：設(shè)相鄰 2個(gè)濃度值的中值為該時(shí)間段的逸出平均濃度,乘以該時(shí)間段的曝氣流量即為該時(shí)間段內(nèi)氣體發(fā)生量,各時(shí)間段內(nèi)氣體發(fā)生量之和,即為一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi) N2O逸出量;依據(jù)亨利定律計(jì)算溶解于液相中的N2O逸出量[15].

2 結(jié)果與分析

2.1 高效脫氮的異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌株的篩選

根椐 1.3.1節(jié)方法,從 SBR反應(yīng)器中的活性污泥中分離得到 10株 BTB陽性菌,依次命名為W YLW 1-1～W YLW 1-10.對(duì)所篩 10株菌進(jìn)行革蘭氏染色,發(fā)現(xiàn)其全部為革蘭氏陽性菌,形態(tài)有長(zhǎng)桿及短桿狀.

對(duì) 10株菌按照 1.3.2節(jié)進(jìn)行反硝化能力測(cè)定.結(jié)果表明,其中有 4株好氧反硝化菌生長(zhǎng)速度較快,且NO3--N去除率和 TN去除率較高.4株菌分別為W YLW 1-3,W YLW 1-4,W YLW 1-6和W YLW 1-7.在此基礎(chǔ)上,按照 1.3.3節(jié)的方法對(duì) 4株菌進(jìn)行異養(yǎng)硝化性能測(cè)定,4株菌的硝化和反硝化性能見表 1.由表 1可知,W YLW 1-3,W YLW 1-4和W YLW 1-6的NH4+-N去除率及 TN去除率均在50%以上.確認(rèn)分離出 3株異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌.

表 1 4株菌的硝化和反硝化性能Tab le 1 N itrification and denitrification perform ance of four bacterial strains

在好氧條件下,W YLW 1-6經(jīng) 4 d培養(yǎng)后NO3--N去除率為 72.19%,反硝化過程中 NO2--N產(chǎn)生量很少,最大值僅為 1.52m g/L,因而 4 d后的TN去除率達(dá)到 72.12%,說明該菌株具有良好的反硝化能力,證實(shí)菌株W YLW 1-6確實(shí)是好氧反硝化菌.此外,W YLW 1-6的異養(yǎng)硝化性能良好,而且該菌株在硝化、反硝化過程中,ρ(NO2--N)一直保持在較低的水平,最高不超過 3.2 m g/L.由劉俊女[15]的研究可知,NO2--N的累積與脫氮中間產(chǎn)物 N2O的生成呈正相關(guān)關(guān)系,而該試驗(yàn)中的 NO2--N的累積量很小,推斷脫氮過程最主要終產(chǎn)物將是 N2.在反硝化、硝化性能測(cè)定過程中,CODCr去除率分別為85.6%和74.3%.

圖 1 N2O的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve ofN2O

2.2 菌株W YLW 1-6的生物學(xué)特征

2.2.1 菌株W YLW 1-6的形態(tài)及生理生化特征

W YLW 1-6的菌落為灰色,圓形,直徑 3～5 mm,光澤度很好,無突起.細(xì)胞為革蘭氏陽性桿菌,產(chǎn)芽孢,無鞭毛,有運(yùn)動(dòng)性,適宜在 20～65℃內(nèi)生長(zhǎng),可耐受 2%的 NaC l濃度,pH生長(zhǎng)范圍 5.6～8.5.生理生化特征結(jié)果：有氧化酶、蛋白酶、明膠酶,無接觸酶.M-R試驗(yàn)陽性,V-P試驗(yàn)陰性,能發(fā)生吲哚反應(yīng),能氧化乙醇.菌株的電鏡照片見圖2.

圖 2 菌株W YLW 1-6的電鏡照片(20 000×)Fig.2 Electronm icroscope ofW YLW 1-6 strain(20 000×)

2.2.2 菌株W YLW 1-6的 16S rRNA基因序列分析和 B io log試驗(yàn)

對(duì)菌株W YLW 1-6進(jìn)行 16S rRNA序列測(cè)定,其序列長(zhǎng)度為1 440 bp.與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),與其具有較高同源性的標(biāo)準(zhǔn)菌株為 Bacillus cereus strain ATCC 21281,相似性為 99%.同時(shí)對(duì)該菌株進(jìn)行了 B io log試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與其相似的菌屬為 Bacillus cereus,相似度 0.644(相似度大于 0.5,表明菌株鑒定結(jié)果的可信度較高[13]),該菌株可利用的最佳碳源為腺苷.2種試驗(yàn)方法的結(jié)果一致,因此確定W YLW 1-6為蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus).

2.3 菌株W YLW 1-6異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化性能

為了優(yōu)選菌株 W YLW 1-6的培養(yǎng)條件,按照

1.3.4 節(jié)的方法對(duì) W YLW 1-6設(shè)計(jì) L4(23)的正交試驗(yàn),結(jié)果見表 2.+-N最大去除率為指標(biāo),各因素影響的主次順序?yàn)棣?NH4+-N)＞碳源＞ρ(CODCr)/ρ(N).對(duì)應(yīng)的最優(yōu)條件：琥珀酸鈉,ρ(CODCr)/ρ(N)為20,ρ(NH4+-N)為80 m g/L;4組試驗(yàn)中,NH4+-N去除率最高可達(dá) 93.80%,CODCr去除率均在 80%以上,證明該菌株確實(shí)進(jìn)行了異養(yǎng)硝化作用,而且發(fā)現(xiàn)菌株W YLW 1-6對(duì)碳源琥珀酸鈉利用情況最好.

在 4組正交試驗(yàn)條件下,僅能夠檢測(cè)出很少量的NO2--N和NO3--N,ρ(NO2--N)最大積累量為2.06m g/L.進(jìn)一步說明了該菌株可以進(jìn)行硝化作用,同時(shí)也進(jìn)行了好氧反硝化作用.在優(yōu)選條件下,該菌的 NH4+-N去除率為 95.21%,高于正交試驗(yàn)中 4個(gè)條件下的最大去除率,證明經(jīng)過分析的優(yōu)選條件確實(shí)可以提高菌株的硝化 -反硝化性能.從各試驗(yàn)條件下 A600和 NH4+-N去除率可以看出,在優(yōu)選條件下W YLW 1-6生長(zhǎng)適應(yīng)性很強(qiáng),在 12 h時(shí)已經(jīng)開始啟動(dòng).因?yàn)橄趸饔脝?dòng)迅速,這樣整個(gè)硝化作用的過程縮短,會(huì)使得完成脫氮作用的時(shí)間也大大縮短,因此脫氮效率得以提高.

2.4 優(yōu)選條件下W YLW 1-6發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)

2.4.1 W YLW 1-6發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)的液相脫氮產(chǎn)物分析

由圖 3可見,W YLW 1-6在經(jīng)發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng),反應(yīng) 56 h后,溶液中的ρ(NH4+-N)有大幅度的降低.初始ρ(NH4+-N)為 84.58 m g/L,56 h后ρ(NH4+-N)降為 2.38 m g/L,NH4+-N去除率達(dá)97.19%,TN去除率為 96.63%,脫氮效果良好.與該菌株的搖瓶培養(yǎng)相比,其 NH4+-N去除率提高了1.98%.最大 A600也有所提高,從 0.796提高到

由表 2的極差分析發(fā)現(xiàn),以 NH40.838.由圖 3可以看出,通過發(fā)酵罐培養(yǎng),該菌株的適應(yīng)環(huán)境能力提高,并且硝化作用啟動(dòng)迅速,比在搖瓶培養(yǎng)的條件下的啟動(dòng)時(shí)間提早了 8 h.過程中菌株利用和消耗碳源顯著.ρ(CODCr)從初始的1 565.20m g/L降到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的 165.60 m g/L,減少了1 399.60m g/L,CODCr去除率達(dá) 89.4%,NO3--N和NO2--N積累少.微生物的脫氮作用實(shí)質(zhì)上就是酶的催化反應(yīng)過程[16],W YLW 1-6能夠達(dá)到脫除NH4+-N的目的,且同時(shí) NO3--N和NO2--N積累很少,可以推斷該菌具有完整的脫氮酶系統(tǒng),可進(jìn)行從NH4+-N→NO3--N→NO2--N→脫氮?dú)怏w產(chǎn)物這一完整的硝化 -反硝化過程.

表 2 W YLW 1-6的 L 4(23)正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis tab le of L4(23)O rthogonal experim entofW YLW 1-6

圖 3 W YLW 1-6在發(fā)酵罐培養(yǎng)下各參數(shù)隨時(shí)間的變化Fig.3 The param eter's cu rve under ferm en tation pot's condition ofW YLW 1-6

2.4.2 W YLW 1-6發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)產(chǎn) N2O氣體分析

采用 1.4.3節(jié)中的 N2O測(cè)定及計(jì)算方法,得到N2O逸出量 (見表 3).由表 3可見,W YLW 1-6產(chǎn)生的N2O是微量的.生物學(xué)控制 N2O逸出的方法即選擇脫氮效果好并可將脫氮反應(yīng)進(jìn)行至完全生成 N2的菌株,一般來說對(duì)異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌株的關(guān)注點(diǎn)僅停留在控制反硝化到氣體產(chǎn)物這一環(huán)節(jié),至此認(rèn)為已經(jīng)能達(dá)到去除廢水中氮的目的,但是對(duì)于氣體產(chǎn)物是N2O還是N2的研究卻不多.反硝化反應(yīng)過程包括 4個(gè)還原步驟,即(涉及 5種含氮物質(zhì),其中后 3種物質(zhì)是氣體).由于氣體NO的毒性很大,菌株為了自身不受傷害,N ir和 Nor還原酶基本成對(duì)出現(xiàn),因此一般脫氮產(chǎn)物是N2O或N2.

由表 3可見,從液相脫氮和 N2O產(chǎn)生情況來看,W YLW 1-6應(yīng)該具備反硝化反應(yīng)全部的 4種酶,而且 Nor還原酶位點(diǎn)需要非常接近 Nos還原酶位點(diǎn),使得產(chǎn)生 N2O的同時(shí)能夠迅速被 Nos還原酶催化還原為N2.

表 3 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下的 N2O的逸出情況Table 3 The em ission ofN2O ofW YLW 1-6 in erm entation pot

3 結(jié)論

a.利用BTB平板培養(yǎng)基和性能測(cè)定,分離篩選出 4株異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌,其中W YLW 1-6脫氮性能尤為突出.經(jīng)鑒定,該菌株屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus).

b.在好氧條件下,W YLW 1-6能夠高效脫氮.正交及優(yōu)選試驗(yàn)表明,W YLW 1-6生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng).用發(fā)酵罐對(duì)W YLW 1-6進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后,NH4+-N去除率可達(dá) 97.19%.N2O-N逸出量占水中脫除 TN的 0.598%.與搖瓶培養(yǎng)相比,NH4+-N去除率提高了 1.98%,而且適應(yīng)環(huán)境能力提高,硝化作用快速啟動(dòng),主要因?yàn)?Nar和 N ir還原酶的活性高,過程中產(chǎn)生的NO3-和NO2-在這些酶的作用下被迅速還原.該菌株有著良好的潛在工程應(yīng)用價(jià)值.

c.W YLW 1-6是一株高效脫氮且 N2O逸出量低的異養(yǎng)硝化 -好氧反硝化菌,W YLW 1-6的 Nor還原酶位點(diǎn)應(yīng)該非常接近 Nos還原酶位點(diǎn),使得脫氮過程中產(chǎn)生的 N2O同時(shí)能夠迅速被 Nos還原酶催化還原為 N2.W YLW 1-6可用于構(gòu)建一個(gè)低 N2O逸出的高效脫氮菌系,實(shí)現(xiàn) N2O生物控逸之目的.產(chǎn)生量的影響[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué),2007,27(5)：633-637.

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Sc reen ing and Iden tifica tion o f a He te ro troph ic N itrifica tion-ae robic D en itrifica tion S tra in w ith N2O Em ission Con tro lAbility

Y IN M ing-rui,WANG Ping,L IU Jian-nan,WANG Lei,L IAo-bo
Schoo lof Chem ical and Environm ental Engineering,Beijing Techno logy and BusinessUniversity,Beijing 100048,China

By using BTB m edium and m easuring nitrification-denitrification characteristics,three heterotrophic nitrification-aerobic denitrification strains were iso lated from a laboratory-m atured SBR reactor.Among them,strain W YLW 1-6 exhibited the highest nitrification-denitrification ability.Based on the analysisof the 16S rDNA gene sequence and the detection of B io log,strainW YLW 1-6 was identified as Bacillus cereus.To research the best hetero trophic nitrification-aerobic denitrification cond itions of strainW YLW 1-6,an orthogonal experim ent of L4(23)was designed in shake flask cu ltivation.The results showed that them axim um removal rate of ammonia nitrogenwas95.21%.Under the op tim al conditions,strainW YLW 1-6 could grow and adap t to the condition rap id ly after inocu lating into thewater.To expand cu lture andm easure the yield of N2O,strainW YLW 1-6 was cultured in ferm entor;the removal ratesof ammonia nitrogen and TN were 97.19% and 96.63% respectively,and total p roduction of N2O was 1.8492 m g,which accounted for 0.598%of the removed TN.Strain W YLW 1-6 can accom p lish the who le bio-denitrification p rocess independently,removing nitrogen efficiently and yielding low N2O.This strain can be used to build a comp lex strain comm unity of low N2O em ission and high nitrogen removal,while realizing bio-contro lofN2O em issions.

Bacillus cereus;heterotrophic nitrification-aerobic denitrification;ferm ento r;bio-contro lofN2O em ission

X501

A

1001-6929(2010)04-0515-06

2009-08-31

2009-12-21

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2007BAK36B07);國(guó)家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展項(xiàng)目(內(nèi)發(fā)改高技字[2008]163號(hào))

尹 明 銳 (1985 -),女,內(nèi) 蒙 古 赤 峰 人,shery032@yahoo.com.cn.

＊責(zé)任作者,汪蘋 (1953-),女,上海人,教授,主要從事水污染控制研究,wangp@th.btbu.edu.cn

(責(zé)任編輯：孔 欣)