張海新，寧久麗，及 華

（1.河北政法職業(yè)學(xué)院園林系，石家莊 050061;2.河北省廊坊市林業(yè)局，廊坊 065000；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，石家莊 050051）

褐變是園藝產(chǎn)品中普遍存在的問題，是果實品質(zhì)劣變最明顯的特征之一，不僅影響果品的外觀、風(fēng)味、營養(yǎng)，而且已成為貯藏加工的主要障礙。全世界每年因褐變造成的果蔬損失超過總損失量的50%[1]。果實褐變與采收后成熟老化生理衰退密切相關(guān)。R M Smock等[2]在蘋果貯藏保鮮研究中發(fā)現(xiàn)有7類生理失調(diào)反應(yīng)，包括凍害、冷害、組織衰老、缺鈣、高CO2、低O2、機械損傷等均能引起果實褐變，由此可見，造成果實褐變的原因來自多方面。果實褐變可分為兩大類，即非酶褐變和酶促褐變。非酶褐變是由各種非酶原因引起的化學(xué)反應(yīng)而造成果肉或果皮褐變，多酚物質(zhì)自動氧化隨后聚合也可產(chǎn)生褐色物質(zhì)引起褐變；酶促褐變是組織內(nèi)的酚類物質(zhì)在酶的作用下氧化成醌類，醌類再聚合形成褐色物質(zhì)而導(dǎo)致組織變色。由于果實褐變多以酶促褐變?yōu)橹?，因此，一直是采后研究的重點。

1 酶促褐變的生化條件

1.1 底 物（酚類物質(zhì)）

果實中酚類物質(zhì)是酶促褐變的主要因素，引起褐變的酚類物質(zhì)有100多種，可分為肉桂酸衍生物、類黃酮化合物、單寧和多巴胺4大類，主要是由碳水化合物代謝衍生出來的產(chǎn)物。雖然酚類物質(zhì)種類繁多，但除了類黃酮外，多數(shù)酚類物質(zhì)的生物合成均來自共同的前體物質(zhì)苯丙氨酸，其它部分由乙酞-COA經(jīng)聚酮酐途徑產(chǎn)生。酚類物質(zhì)作為酶促褐變的底物有很多報道，杏果實中的酚類物質(zhì)主要是綠原酸，褐變顏色的深淺主要取決于黃烷酮的含量[3]。桃果實中PPO的天然底物因品種不同而不同，大久保桃中PPO的最主要底物是咖啡酸,而綠化3號桃則是兒茶酚[4]。馬巖松等研究認為，綠原酸是南果梨褐變過程中的主要底物[5]，吳耕西等（1992）在鴨梨上同樣證明酶促褐變的底物是綠原酸。有研究認為，蘋果在生長期主要的酚類物質(zhì)是4-甲基兒茶酚和表兒茶酸；蘋果采后貯藏過程中,主要的酚類物質(zhì)是綠原酸和咖啡酸[6]?？梢姡煌N類的果實酶促褐變的底物不同，同一類果實在不同的生長發(fā)育階段其底物也有可能不同。

1.2 與褐變有關(guān)的酶類

國內(nèi)外的研究一致認為，與酶促褐變密切相關(guān)的酶類主要是多酚氧化酶(PPO)，它是一種含銅離子的膜蛋白酶，大多存在于細胞中，有的也存在于細胞膜與細胞壁中。PPO所能引起的反應(yīng)常會使果肉褐變，產(chǎn)生異味，并造成營養(yǎng)成分損失等。PPO能夠催化兩類不同的反應(yīng)：一類是一元酚羥基化，生成相應(yīng)的鄰二羥基化合物；第二類是氧化鄰苯二酚生成鄰苯醌,兩類反應(yīng)均是需氧反應(yīng)。L Marques等（1995）對PPO進行分離純化鑒定后認為，PPO有幾種不同的存在形式，其中最重要的一種相對分子質(zhì)量為64 000[8]。在未成熟的果實中，有活性的PPO大多存在于果心部位[7],T Wakayama（1995）研究表明，果心處的PPO活性最高，其次是果肉，最后是果皮,這與果實從果心向果皮褐變的過程吻合。研究還發(fā)現(xiàn)PPO有同工酶存在，依據(jù)是在不同pH環(huán)境條件下PPO的活性出現(xiàn)兩個以上的峰值[4,8]。對分離的PPO同工酶性質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)，同工酶間的性質(zhì)差別較大。關(guān)于PPO活性最適宜的pH環(huán)境，研究結(jié)果存在爭議。T Wakayama（1995）研究認為，pH 3.8最適宜,而其他人研究則認為pH 6.2[9]或pH 5.6[4]最適宜。而對PPO熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果相對比較一致，在 60 ℃以上仍有部分活性[8，9]。

1.3 氧

氧氣是生物生命活動的主要參加物質(zhì)，也是生命活動中不可缺少的。正常的果實是完整的有機體，具有天然氧的屏障系統(tǒng)，植物組織通過表皮、氣孔、皮孔、細胞間隙等氣體交換系統(tǒng)完成植物生命過程的氧氣需要，多余的氧氣被排斥在組織以外，使組織與氧隔絕不褐變，說明植物組織具有很好的保護系統(tǒng)。有研究發(fā)現(xiàn)，代謝過程產(chǎn)生的活性氧是酶促褐變的主要需氧條件，O2-和H2O2是生物體內(nèi)主要的活性氧。O2可還原基質(zhì)，也可使基質(zhì)氧化,H2O2在需氧的活動部位產(chǎn)生,并主要作為氧化劑。

2 酶促褐變的生理機制

果實褐變是一個復(fù)雜的生理活動過程，盡管前人進行了大量研究，但目前仍然不能確切闡明其生理變化機理。研究人員先后提出了多種學(xué)說理論，其中酚-酚酶的區(qū)域化分布學(xué)說是目前比較被接受的解釋酶促褐變的學(xué)說之一。有研究發(fā)現(xiàn)，果實中的酚類物質(zhì)與PPO存在著區(qū)域性分布，正常的植物組織不發(fā)生褐變主要與細胞內(nèi)酚類物質(zhì)和酶的區(qū)域化分布有關(guān)。鞠志國等（1988）研究證實，萊陽茬梨果實中酚類物質(zhì)貯存和積累在液泡中，但不含PPO，PPO主要集中在細胞質(zhì)中，也有存在于細胞膜和細胞壁上，證明了PPO與多酚的區(qū)域性分布。酚類物質(zhì)與PPO的區(qū)域性分布保護了組織細胞的正常生理活動，從而防止了褐變的發(fā)生。假如果實在貯藏期間或采前生理失調(diào)，就有可能打破這些物質(zhì)的區(qū)域化分布,使酶和底物相互接觸，導(dǎo)致褐變的發(fā)生。

研究還發(fā)現(xiàn)，果實褐變的發(fā)生與清除活性氧自由基的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性下降以及膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）和H2O2的增加有密切的關(guān)系。蔣躍明等（1991）對香蕉褐變進行研究,證實了膜脂過氧化作用參與香蕉的褐變過程。低溫條件下香蕉果皮PPO活性增高與游離態(tài)PPO比值增大，褐變伴隨細胞還原勢迅速降低，液泡膜和質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)破壞，組織內(nèi)過氧化物含量增加有關(guān)。另外，外源H2O2和抗氧劑處理對果皮褐變和過氧化物含量分別起到促進與抑制作用，說明褐變機理不只是PPO參與的酚類物質(zhì)氧化過程，還包括了細胞氧化還原代謝失調(diào)和細胞結(jié)構(gòu)的破壞。

3 引起果實褐變的主要因素

3.1 冷 害

許多原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶或高溫季節(jié)成熟的果實，在不適宜的低溫條件下貯藏，往往會發(fā)生冷害，冷害發(fā)生的主要癥狀之一就是組織褐變。盡管冷害的發(fā)生機理目前還處在不斷探索階段，但相關(guān)研究一致認為，冷害會導(dǎo)致細胞膜受傷害。在冷害溫度條件下，細胞膜系統(tǒng)發(fā)生相變，不飽和脂肪酸和磷脂含量比例下降，膜脂由液晶態(tài)轉(zhuǎn)為凝膠態(tài)，細胞膜收縮產(chǎn)生裂痕，致使透性增加，透性變化直接擾亂細胞內(nèi)的離子平衡，造成離子外滲，也就打破了細胞內(nèi)多酚與PPO的區(qū)域化分布。這樣，一方面會引起細胞的代謝失調(diào)且影響其正常的生命活動；另一方面代謝的中間產(chǎn)物如丙酮、乙醛、乙醇、多酚等會增多并累積，這又會進一步加快組織細胞的衰老和崩潰。但這種影響在短期低溫內(nèi)是可逆的，如果在長期低溫條件下，細胞膜將發(fā)生不可逆的相變，這些有毒物質(zhì)可使細胞受害，出現(xiàn)冷害癥狀。

3.2 氣體傷害

通常低O2與高CO2等不適宜的氣體成分會造成果實的褐變。果實置于O2濃度在1%～3%的環(huán)境中貯藏比較適宜。蘋果在低氧的條件下，果皮表面會產(chǎn)生褐色斑，果肉形成褐色的軟木斑和空洞，進而導(dǎo)致腐爛發(fā)生。亞洲梨在0℃、O2濃度為1%的條件下貯藏4個月，果實表皮會出現(xiàn)青銅色凹陷，鴨梨和雪花梨在0℃、O2濃度為1%的條件下貯藏4個月，果實表皮也會發(fā)生褐變[10]。高CO2環(huán)境下無論低溫或常溫貯藏，都會造成果實傷害，主要表現(xiàn)為果肉硬化、品質(zhì)衰敗、產(chǎn)生異味。此外，還可使琥珀酸、丙氨酸積累，延胡索酸、天冬氨酸減少，呼吸代謝的三羧酸循環(huán)系統(tǒng)受到破壞，使果實正常生命活動難以完成，造成有害物質(zhì)積累和細胞膜傷害，從而發(fā)生酶促反應(yīng)，使組織產(chǎn)生褐變。氣體傷害引起的褐變與果實種類、采收時間、貯藏溫度、貯藏時間等因素相關(guān)。

3.3 礦物質(zhì)元素缺乏

有關(guān)研究表明，果樹生長期間或采收后用無機鹽處理會抑制褐變的發(fā)生或減輕褐變，但無機鹽防止褐變的機理尚未清楚。果實在生長發(fā)育過程中，缺乏礦物質(zhì)元素會影響生命活動的完成，出現(xiàn)生理失調(diào)，尤其是某些生物體內(nèi)含量較少且不可取代的物質(zhì)，對果實的生長發(fā)育和正常代謝具有明顯的影響。例如果實鈣素匱乏則細胞壁形成受阻，系統(tǒng)形成不完整，或不能與果膠酸結(jié)合成果膠酸鈣而使果膠酸過多，造成細胞壁破壞和分解，使質(zhì)膜呈片斷狀或局部松馳，細胞壁厚薄不均勻，細胞膜系統(tǒng)極易遭受破壞，導(dǎo)致褐變發(fā)生[2]。

3.4 果實成熟度與果實大小

成熟度對果實與果肉的褐變影響很大，采收期的早晚對酶促褐變的影響可能是組織衰老和自身保護酶系統(tǒng)互相作用的結(jié)果。經(jīng)研究表明，晚采收的桃果實比早采收的桃果實容易發(fā)生褐變。不同大小的果實在貯藏過程中的褐變程度不同，一般大果實比小果實易發(fā)生褐變，原因可能與貯藏后期果心釋放出來的CO2不能及時排出有關(guān)。

4 防止果實褐變的技術(shù)措施

4.1 貯藏溫度調(diào)控

冷害是引起果實褐變的重要因素，采用熱處理和間歇加溫等溫度調(diào)節(jié)措施可以有效地預(yù)防或減少冷害褐變的發(fā)生。采后熱處理可以改善由于冷害引起的細胞壁物質(zhì)代謝的異常，并可誘導(dǎo)合成小分子量的熱激蛋白，減輕或抑制冷害的發(fā)生；同時熱處理還可降低某些氧化酶如苯丙氨酸氧化酶、多酚氧化酶與過氧化物酶的活性，抑制組織褐變，改善貯藏品質(zhì)。筆者經(jīng)研究證實，采用50℃熱水處理可以明顯地延長冬棗和贊皇大棗的貯藏保鮮期；羅自生等研究發(fā)現(xiàn)，熱激處理可以減輕柿果實冷害癥狀，顯著降低低溫冷害[11]。

目前，研究較多的變溫模式為間歇加溫，即冷敏感性果蔬在低溫貯藏期間采取多次短期升溫處理，使組織代謝恢復(fù)正常，可延緩甚至避免冷害的發(fā)生。D M Dawson等（1995）對桃果實和油桃果實進行間歇升溫處理來延緩冷害發(fā)生，延長貯藏壽命。都鳳華等（1994）研究表明，間歇加溫可有效地降低李子果實呼吸強度和乙烯釋放量，抑制冷害的發(fā)生。許多研究證明，間歇升溫對梨、桃、檸檬、芒果、李等果實冷害發(fā)生均有一定的延緩作用。

4.2 氣體調(diào)節(jié)

調(diào)控貯藏果實的氣體環(huán)境是控制褐變的有效方法之一，目前采用的方式有氣調(diào)貯藏、減壓貯藏和自發(fā)氣調(diào)貯藏等。上述方法通過降低O2濃度而相應(yīng)提高CO2濃度,使之達到適宜比例,防止褐變。鞠志國報道[12]，O2濃度在5%～10%時，CO2濃度與果肉褐變呈正相關(guān)；CO2濃度相同條件下,果實不受O2（5%～20%）濃度變化的影響。在桃果實貯藏過程中，控制其貯藏環(huán)境中適宜的O2和CO2濃度可以有效地延長貯藏期。減壓貯藏同樣也是創(chuàng)造一個低氧環(huán)境，促進果實內(nèi)氣體成分向外擴散，減少代謝和有毒物質(zhì)的積累而延緩衰老。但由于不同種類的果蔬在遺傳與生理方面存在差異,對貯藏環(huán)境中的O2和CO2濃度的反應(yīng)也不相同。

4.3 化學(xué)藥劑處理

通過化學(xué)藥劑抑制果蔬酶促褐變過程可達到抑制或延緩果實褐變的目的。應(yīng)用較多的化學(xué)藥劑主要有鈣處理、酸處理、抗氧化劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、PPO抑制劑、基質(zhì)甲基化法等。鈣處理主要是防止仁果類如梨和蘋果等果實的褐變。如雪花梨在常壓條件下浸泡于濃度為6%的CaC12溶液5 min或減壓條件下浸泡于濃度為4%的CaC12溶液2 min，均能使果肉酚類物質(zhì)保持在較高水平，抑制PPO活性并維持細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[13]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，焦亞硫酸鈉、食鹽、EDTA、谷胱甘肽、檸檬酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、二氧化硫、硫磺等化學(xué)藥劑均有一定程度的抑制果實酶促褐變的作用。例如在防止甘薯的褐變中抗壞血酸效果最好，檸檬酸次之，0.20%檸檬酸+0.05%抗壞血酸為最佳組合，而氯化鈉效果稍差[14]。外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以改變果實內(nèi)源激素的平衡,進而調(diào)節(jié)果實的生理代謝，增強果實的耐冷性，減少褐變的發(fā)生，通常應(yīng)用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有ABA、GA3、2,4-D、多胺等。王勇等研究發(fā)現(xiàn)，用ABA處理可減輕貯于8℃條件下香蕉的冷害與褐變[15]；田世平等用GA3和鈣處理冬雪蜜桃，顯著地減輕了貯藏期間果心的褐變程度[16]。國內(nèi)外做了大量酶抑制劑的應(yīng)用研究工作，探明不同植物中PPO的分子型、銅離子的存在狀態(tài)不同，對不同的抑制劑會產(chǎn)生不同的反應(yīng)。研究結(jié)果表明，利用半胱氨酸抑制梨濃縮果汁以及蘋果、馬鈴薯的褐變，利用亞硫酸氫鈉保持荔枝的色澤等均可取得較好效果。有關(guān)PPO抑制劑的報道很多，但在生產(chǎn)應(yīng)用方面還難以取得令人滿意的效果。

4.4 采前管理與采收期控制

果實成熟度越高，組織衰老越快，褐變也隨之加重，同時褐變與果樹栽培管理和果實營養(yǎng)水平也有一定關(guān)系。擬用于貯藏的果實要在充分長大、但尚未完全成熟之前采收，不同品種果實的最佳貯藏期存在明顯差異，同一品種不同采收期果實的處理方式也不同。筆者利用七成、八成、九成成熟度的黑寶石李進行低溫貯藏試驗，結(jié)果表明，八成熟的果實貯藏效果最好，七成熟次之，九成熟最差。

5 未來的研究方向

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展與進步，通過基因工程培育抗褐變果蔬品種己經(jīng)成為現(xiàn)實。C W B Bachem等（1996）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，分別將PPOcDNA片段和cDNA全長加上合適的啟動子，反向插入到馬鈴薯的染色體組內(nèi)，成功獲得了抗褐變的馬鈴薯新品系，這一成功技術(shù)證明基因工程可以運用到果蔬抗褐變品種培育中。隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，尤其是酶純化技術(shù)、免疫技術(shù)、PCR技術(shù)、反義RNA技術(shù)等的成功應(yīng)用，番茄、馬鈴薯、甘薯、菠菜、葡萄、菠蘿、蘋果、梨、桃、日本枇杷、中國木瓜、荔枝、茶樹等園藝植物的PPO基因已被克隆，有望進一步應(yīng)用于蘋果、香蕉、梨等抗褐變果蔬的培育改良上，為控制果蔬等農(nóng)產(chǎn)品的酶促褐變提供一條新途徑。

另外，對果實褐變因素進行深入研究，從分子水平搞清酶促褐變機理，有望為控制酶促褐變提供切實可行的新方法。

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