周四桂，袁 茜，潘雪刁，金桂芳，徐立朋

NF-κB受體活化因子配體(RANKL)又稱骨保護(hù)素配體(OPGL)、腫瘤壞死因子相關(guān)性活化誘導(dǎo)因子(TRANCE)、破骨細(xì)胞分化因子(ODF)等，RANKL是破骨細(xì)胞(Osteocalst，OC)生成及發(fā)揮骨吸收功能必需的細(xì)胞因子［1－3］。1998 年，Lacey等［2］用重組OPG-Fc融合蛋白作免疫探針發(fā)現(xiàn)在鼠類骨髓單核細(xì)胞系32D上有OPG結(jié)合分子的表達(dá)，并將其克隆成功，確認(rèn)為 OPG配體(OPGL)。RANKL可分為膜結(jié)合蛋白型和可溶性蛋白型，這兩種類型的RANKL均可與OC前體細(xì)胞表面的RANK受體結(jié)合，從而直接刺激OC的分化［4］。

BAPTA-AM是一種細(xì)胞內(nèi)的快速鈣離子絡(luò)合劑，從而干擾正常Ca2+的釋放和重?cái)z取，阻斷Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］，由于PKC作為一種依賴于Ca2+的激酶，其活性也可被BAPTA-AM抑制。目前有關(guān)BAPTA-AM與破骨細(xì)胞的關(guān)系研究尚不完全清楚。為了觀察BAPTA-AM對RANKL誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的影響，本實(shí)驗(yàn)在M-CSF和RANKL兩種細(xì)胞因子共同存在的條件下，建立體外骨髓誘導(dǎo)破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察BAPTA-AM對破骨細(xì)胞分化的影響，并以ERK1/2和p38MAPK為靶點(diǎn)進(jìn)一步探索其發(fā)揮抑制作用的信號通路機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級4周齡，♀小鼠8只，體質(zhì)量(19±3)g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FCS)購于美國Gibco公司;M-CSF和rhsRANKL均購于英國PeproTech公司;BAPTA-AM和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒均購于 Sigma-Aldrich公司;抗 ERK 1/2、p-ERK 1/2、p38MAPK 和p-p38MAPK均購于Cell Signaling Technology公司。

1.3 破骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法 用蒸餾水沖洗鼠體后拉頸脫位處死，75%乙醇浸泡5 min。無菌條件下分離股骨及肱骨，剪斷兩側(cè)骨骺端，用注射針頭將 RPMI 1640(含100 kU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素，2 mmol·L－1L-谷胺酰氨，10%FCS)輕輕沖洗骨髓腔，吸取上層細(xì)胞懸液，以1×108·L－1的濃度均勻接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加全培養(yǎng)液至1 ml，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)根據(jù)培養(yǎng)液中是否加入 M-CSF(50 μg·L－1)、RANKL(50 mg·L－1)和不同濃度的BAPTA-AM分組。將分組的細(xì)胞混合液移入培養(yǎng)板中并放入培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，培養(yǎng)過程中每天定期觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。于d 5～d 7進(jìn)行細(xì)胞觀察、計(jì)數(shù)及生化指標(biāo)測定。

1.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 將細(xì)胞玻片固定后，按試劑盒說明進(jìn)行操作，中性樹膠封片，光鏡下觀察。以TRAP+多核細(xì)胞(≥3)為破骨細(xì)胞，對每個(gè)玻片隨機(jī)取5～10個(gè)視野(×200)中的破骨細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 免疫印記法(Western blot)檢測p-ERK 1/2和p-p38MAPK的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)因素處理后，離心收集。使用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入裂解緩沖液(50 mmol·L－1Tris-HCl，150 mmol·L－1NaCl，0.2 g·L－1NaN3，1 g·L－1SDS，1.0 mmol·L－1PMSF，1 mg·L－1aprotinin，1.0 g·L－1NP40，5.0 g·L－1Na3VO4，1 mg·L－1leupeptin，pH 8.0)振蕩混勻，冰浴30 min，4℃ 12 000×g離心10 min，取上清，即為胞質(zhì)蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PBST洗膜5 min。室溫下用5%脫脂奶粉(PBST溶解)封閉PVDF膜1 h。隨后加入抗 ERK 1/2、p-ERK 1/2、p38MAPK、p-p38MAPK(1 ∶1 000)或抗 β-actin(1∶2 000)4℃孵育過夜。PBST洗脫3次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h，漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室中曝光到X光片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞活體觀察 由Fig 1可以看出，培養(yǎng)1 h后開始出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，大多為體積較小的單核圓形細(xì)胞，大小基本一致，分布比較均勻;培養(yǎng)d 2細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)變化，出現(xiàn)散在的大型細(xì)胞，局部出現(xiàn)細(xì)胞聚集，但各組細(xì)胞密度未見明顯變化;細(xì)胞培養(yǎng)d 3～d 4，各組不規(guī)則細(xì)胞數(shù)量增加，體積增大，形態(tài)演變?yōu)榇髨A形、花瓣形等，有些細(xì)胞出現(xiàn)偽足，胞質(zhì)內(nèi)可見多核，成為破骨細(xì)胞;培養(yǎng)d 7破骨細(xì)胞形成逐漸達(dá)到高峰，細(xì)胞核大多有3個(gè)或3個(gè)以上。

Fig 1 The observation of mouse BMMs or osteoclasts(200×)

2.2 BAPTA-AM對小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分化的影響 用M-CSF、RANKL和加入不同濃度BAPTA-AM(0.5、1 和 2 μmol·L－1)的 RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓巨噬細(xì)胞7 d，收集誘導(dǎo)分化的骨髓巨噬細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)TRAP陽性細(xì)胞核數(shù)在3～10或＞10的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示含有RANKL的陽性對照組骨髓巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見多核，分化成為破骨細(xì)胞。不同濃度的BAPTA-AM對破骨細(xì)胞的形成具有明顯的抑制作用，且隨著濃度劑量依賴性地降低 TRAP 陽性細(xì)胞數(shù)目，2 μmol·L－1BAPTAAM能使骨髓巨噬細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的數(shù)量較對照組明顯降低(P＜0.01)，見Fig 2。

Fig 2 The effect of BAPTA-AM on the osteoclastogenesis of BMMs(n=3)

2.3 BAPTA-AM對RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞存活的影響 Fig 3結(jié)果顯示，與對照組相比，RANKL能明顯地誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞(P＜0.05)，而與RANKL組相比，BAPTAAM能明顯地抑制RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞存活(P＜0.05)。

Fig 3The effect of BAPTA-AM on osteoclast survival±s，n=3)Mouse osteoclasts were treated with 2 μmol·L －1BAPTA-AM or vehicle.The medium was then changed and osteoclasts were incubated with RANKL(100 μg·L－1)or vehicle at 37℃ for 24 h.The number of osteoclasts per dish at 24 h was expressed as a percentage of the initial number of osteoclasts in the same dish.Osteoclast survival was significantly greater in cultures treated with RANKL alone than under all other conditions(P＜0.05).*P ＜0.05 vs control.#P ＜0.05 vs sample treated with only RANKL

2.4 BAPTA-AM對RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞ERK1/2和p38MAPK磷酸化的影響 為了探討B(tài)APTA-AM對RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞形成和存活的機(jī)制，我們從ERK1/2和p38MAPK信號通路來研究BAPTA-AM對其磷酸化水平的影響，F(xiàn)ig 4結(jié)果顯示，RANKL處理能明顯地誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化(P＜0.01)。而與 RANKL組相比，BAPTA-AM能明顯地抑制RANKL誘導(dǎo)的胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，并隨著濃度增加這種抑制作用更加明顯。

3 討論

Fig 4 Effect of BAPTA-AM on ERK1/2 and p38MAPK phosphorylation stimulated by RANKL(n=3)Protein extracts were prepared after treatment with/without 12.5，25 and 50 μmol·L －1BAPTA-AM for 1 h before incubation with 25 μg·L －1RANKL for 8 h.Immunoblotting assays were performed with an antibody against phosphorylated ERK1/2(p-ERK1/2)，phosphorylated p38 MAPK(p-p38 MAPK)，ERK1/2 and p38 MAPK.In the RANKL alone treatment，the expression of p-ERK1/2 and p-p38 was higher than that of control，and BAPTA-AM inhibited RANKL-induced ERK1/2 and p38 phosphorylation dose-dependently.＊＊P ＜0.01 vs control.##P ＜0.01 vs sample treated with only RANKL

正常骨代謝過程是一種骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡過程，這一過程受到體內(nèi)外許多因素的調(diào)控，如年齡、性別、營養(yǎng)狀況、生活習(xí)慣、疾病等。這些方面一旦出現(xiàn)問題，均會導(dǎo)致骨代謝受阻，引發(fā)骨質(zhì)疏松，其本質(zhì)在于骨重建過程紊亂，即破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成。破骨細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞的單核巨噬細(xì)胞系，其分化過程中涉及 NF-κB活化受體(RANK)/骨保護(hù)素(OPG)/RANK配體(RANKL)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。RANKL表達(dá)于成骨細(xì)胞表面與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，與巨噬細(xì)胞克隆刺激因子(M-CSF)一起啟動破骨細(xì)胞的分化。研究表明M-CSF和RANKL是破骨細(xì)胞形成、分化和成熟過程中所必須有的兩種細(xì)胞因子［4］。本實(shí)驗(yàn)在原有破骨細(xì)胞骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，成功建立了以M-CSF和RANKL為共同誘導(dǎo)分化因子的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，在這種培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的形態(tài)和生長變化符合破骨細(xì)胞特點(diǎn)。

BAPTA-AM是一種細(xì)胞內(nèi)的快速鈣離子絡(luò)合劑，從而干擾正常Ca2+的釋放和重?cái)z取，阻斷Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5－6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RANKL 誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見多核，分化成為破骨細(xì)胞。不同濃度的BAPTA-AM對破骨細(xì)胞的形成具有明顯的抑制作用且隨著濃度增加明顯地降低TRAP陽性細(xì)胞數(shù)目。為了進(jìn)一步探討B(tài)APTA-AM對RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞形成和存活的機(jī)制，我們從ERK1/2和p38MAPK信號通路［7］來研究BAPTA-AM對其磷酸化水平的影響。ERK1/2和p38MAPK是MAPK信號傳導(dǎo)通路中經(jīng)典的信號蛋白分子，MAPK是一類由脯氨酸介導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過Ⅷ區(qū)域蘇氨酸、酪氨酸雙位點(diǎn)磷酸化活化，激活的MAPK通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白、其它酶類等不同底物來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過程，其中ERK主要通過Ras→Raf→MAPK/ERK 激酶(MAPK/ERK kinase，MEK1/2)被激活，可能與生理性信號傳導(dǎo)有關(guān)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，有利于損傷的修復(fù)和細(xì)胞的再生，對破骨細(xì)胞的形成、生存、分化及刺激骨吸收有重要作用。而p38MAPK則主要參與傷害性應(yīng)激信號的傳導(dǎo)，與破骨細(xì)胞的生成和凋亡有關(guān)［8－9］。其主要通過P21激活蛋白激酶(P21-activated kinase，PAK)→混合譜系激酶 (mixed lineage kinase，TAK/ASK/MLK)→MKK3/MKK6被激活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RANKL處理能明顯地誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化。而與RANKL組相比，BAPTAAM能明顯地抑制RANKL誘導(dǎo)的胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，并隨著濃度增加這種抑制作用更加明顯。說明Ca2+釋放形成的Ca2+信號在RANKL誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分化成為破骨細(xì)胞中起著重要作用，促進(jìn)了胞質(zhì) ERK1/2和p38MAPK 的磷酸化水平［10－12］。

綜上所述，Ca2+信號通路在RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞形成和存活過程中起著至關(guān)重要的作用，BAPTA-AM作為一種快速高效的Ca2+絡(luò)合劑，明顯地抑制RANKL誘導(dǎo)的胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，在體外可有效地抑制破骨細(xì)胞的形成與分化，延緩骨吸收過程。

［1］Ueki Y，Lin C Y，Senoo M，et al.Increased myeloid cell responses to M-CSF and RANKL cause bone loss and inflammation in SH3BP2“cherubism”mice［J］.Cell，2007，128(1):71 － 83.

［2］Lee S H，Kim T，Jeong D，et al.The tec family tyrosine kinase Btk Regulates RANKL-induced osteoclast maturation［J］.J Biol Chem，2008，283(17):11526 －34.

［3］Wittrant Y，Gorin Y，Mohan S，et al.Colony-stimulating factor-1(CSF-1)directly inhibits receptor activator of nuclear factor-{kappa}B ligand(RANKL)expression by osteoblasts［J］.Endocrinology，2009，150(11):4977 －88.

［4］Anandarajah A P.Role of RANKL in bone diseases［J］.Trends Endocrinol Metab，2009，20(2):88 －94.

［5］Furuta A，Tanaka M，Omata W，et al.Microtubule disruption with BAPTA and dimethyl BAPTA by a calcium chelation-independent mechanism in 3T3-L1 adipocytes［J］.Endocr J，2009，56(2):235－43.

［6］宋必衛(wèi)，儲昭興.BAPTA-AM的研究現(xiàn)狀［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(7):851 －3.

［6］Song B W，Chu Z X.The research progress of BAPTA-AM［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):851 －3.

［7］廖新學(xué)，王艷麗，郭瑞鮮，等.ERK1/2介導(dǎo)H2O2預(yù)處理對抗氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(9):1151－6.

［7］Liao X X，Wang Y L，Guo R X，et al.ERK1/2 mediates the cytoprotection of H2O2preconditioning against oxidative injury in PC12 cell［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(9):1151 － 6.

［8］Li X，Udagawa N，Itoh K，et al.p38 MAPK-mediated signals are required for inducing osteoclast differentiation but not for osteoclast function［J］.Endocrinology，2002，143(8):3105 －13.

［9］張玉軍，郝 軍，劉淑霞，等.p38MAPK在戊地昔布誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(4):497－501.

［9］Zhang Y J，Hao J，Liu S X，et al.Regulatory effect of p38MAPK signal pathway on the apoptosis of human esophageal cancer cells induced by valdecoxib［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(4):497－501.

［10］Liu Q H，Zheng Y M，Korde A S，et al.Membrane depolarization causes a direct activation of G protein-coupled receptors leading to local Ca2+release in smooth muscle［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(27):11418 －23.

［11］Peng J，Bencsik M，Louie A，et al.Conditional expression of a Gicoupled receptor in osteoblasts results in trabecular osteopenia［J］.Endocrinology，2008，149(3):1329 －37.

［12］Ding Q，Wang Q，Evers B M.Alterations of MAPK activities associated with intestinal cell differentiation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，284(2):282 －8.