閆銀萍，孫黔云

補(bǔ)體是人體重要的免疫防御系統(tǒng)，但過(guò)度激活會(huì)引發(fā)一系列的病理生理反應(yīng)，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展［1］。尋找有效的補(bǔ)體抑制成分，能為探索相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，以及預(yù)防和治療由補(bǔ)體引起的各種炎癥反應(yīng)及相關(guān)的病理?yè)p傷提供物質(zhì)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。蛇毒是自然界中最復(fù)雜的動(dòng)物毒素，含有多種蛋白質(zhì)、多肽及酶類(lèi)，很多蛇毒都對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)有作用［2］，蛇毒已成為尋找和發(fā)現(xiàn)新型抗補(bǔ)體蛋白的重要資源庫(kù)。烙鐵頭蛇(Trimeresurus mucrosquamatus)是我國(guó)常見(jiàn)劇毒蛇之一，主要分布在我國(guó)南方及臺(tái)灣地區(qū)，其蛇傷較為常見(jiàn)，臨床主要表現(xiàn)為局部出血、腫脹、疼痛，嚴(yán)重時(shí)血液不凝，全身出血等［3］。至今已從烙鐵頭蛇毒中分離純化出與纖溶和血小板相關(guān)的多個(gè)活性成分［4-6］，但總體上對(duì)烙鐵頭蛇毒尚缺乏系統(tǒng)深入的研究。針對(duì)烙鐵頭蛇毒蛋白開(kāi)展相關(guān)研究對(duì)于認(rèn)識(shí)和揭示烙鐵頭蛇傷機(jī)制和臨床治療以及潛在應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。本文報(bào)道了烙鐵頭蛇毒中一個(gè)具有抗補(bǔ)體活性金屬蛋白酶的分離純化及部分性質(zhì)研究。

1 材料與方法

1.1 材料 烙鐵頭蛇毒產(chǎn)自湖南省武陵山區(qū);眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)參照文獻(xiàn)［7］制備;人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng);DEAE Sephadex A-50凝膠、Sephacryl S-100凝膠、Hitrap SP HP柱(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體(溶血素)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸［Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N，N，N′，N′-tetraacetic acid，EGTA)］、纖維蛋白原、苯甲酰-L-精氨酸乙酯(Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride，BAEE)、偶氮酪蛋白(azocasein，美國(guó)Sigma公司);蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(大連TaKaRa公司);人補(bǔ)體單一成分C3、C5(德國(guó)Calbiochem公司);P-selectin試劑盒(武漢博士德生物有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所);綿羊紅細(xì)胞、兔紅細(xì)胞采自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;♀昆明種小鼠購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(黔)2002-0001;混合人血清由本實(shí)驗(yàn)室健康志愿者獻(xiàn)血制備而得;其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 AKTA Prime蛋白層析系統(tǒng)、Gene Quant紫外分光光度計(jì)(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);Spectra MAX-190連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司);5810R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 烙鐵頭蛇毒抗補(bǔ)體蛋白的分離純化 1.0 g烙鐵頭蛇粗毒干粉溶于7 ml的50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 8.9)，2 000 r·min-1離心 10 min后取上清上樣于同種緩沖液平衡好的DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析柱(2.6 cm×90 cm)，充分洗脫后進(jìn)行0～0.4 mol·L-1NaCl梯度洗脫，流速為24 ml·h-1，每管收集6 ml，測(cè)定各洗脫峰抗補(bǔ)體活性。將活性峰凍干后溶于1 ml 10 mmol·L-1PB緩沖液(pH 7.5)，上樣于同種緩沖液平衡好的Sephacryl S-100凝膠柱(1.6 cm×90 cm)，流速為15 ml·h-1，每管 3 ml。收集活性峰上樣于 AKTA Prime 1 ml HiTrap SP HP陽(yáng)離子交換層析柱，流速為1 ml·min-1，收集活性峰。SDS-PAGE檢測(cè)純度，更換緩沖液為 PBS緩沖液，BCA蛋白定量后于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分子量及等電點(diǎn)測(cè)定 15%SDS-PAGE測(cè)定目標(biāo)蛋白在還原與非還原條件下的表觀分子量，方法參照文獻(xiàn)［8］。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為磷酸酶b(97.2 ku)、牛血清蛋白(66.4 ku)、卵清蛋白(44.3 ku)、碳酸苷酶(29.0 ku)、胰蛋白酶抑制劑(20.1 ku)、溶菌酶(14.3 ku)。

等電聚焦測(cè)定目標(biāo)蛋白變性條件下的等電點(diǎn)，方法參照文獻(xiàn)［8］。

1.3.3 抗補(bǔ)體活性測(cè)定

1.3.3.1 經(jīng)典途徑溶血抑制作用測(cè)定 將樣品溶液、人血清(GGVB++緩沖液1∶10稀釋)各50 μl混合后于37℃預(yù)孵30 min或不預(yù)孵，加入100 μl致敏綿羊紅細(xì)胞(5×1011cells·L-1，GGVB++緩沖液配制)，37℃水浴孵育30 min后，加入1 ml冷生理鹽水終止反應(yīng)，2 000 r·min-1離心10 min，取上清于405 nm測(cè)定吸光度。

1.3.3.2 替代途徑溶血抑制作用測(cè)定 樣品溶液、人血清(GVB-緩沖液1∶3稀釋)各50 μl混合后于37℃預(yù)孵30 min或不預(yù)孵，加入100 μl兔紅細(xì)胞(1.5×1011cells·L-1，GVB-Mg-EGTA 緩沖液配制)，37℃水浴孵育30 min后再加入0.5 ml冷生理鹽水終止反應(yīng)，2 000 r·min-1離心10 min，取上清于405 nm測(cè)定吸光度。

1.3.4 補(bǔ)體單一成分C3、C5酶切裂解檢測(cè) 10 μl目標(biāo)蛋白(5 μg)分別與 5 μl人 C3、C5蛋白(各 5 μg)于37℃水浴孵育4 h，12%SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.5 P-selectin檢測(cè) 22 μg目標(biāo)蛋白與50 μl人血清(PBS緩沖液1∶10稀釋)37℃預(yù)孵30 min，加至孵育24 h的以5×107cells·L-1接種于96孔板的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)中，培養(yǎng)20 min后，取細(xì)胞上清，2 000 r·min-1離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定P-selectin。以眼鏡蛇毒因子(CVF)激活補(bǔ)體誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放P-selectin作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6 蛋白水解酶活性檢測(cè)

1.3.6.1 纖維蛋白原水解活性 參照文獻(xiàn)［8］的方法加以改動(dòng)。300 μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%纖維蛋白原溶液(600 μg，50 mol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，0.15 mol·L-1NaCl配制)加入150 μl目標(biāo)蛋白溶液(10 μg)于37℃水浴孵育1/12、1/2、1、3、6、9、12、24 h 和36 h后，12%SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.6.2 精氨酸酯酶活性 參照文獻(xiàn)［8］的方法。BAEE作為底物，100 μg目標(biāo)蛋白加至3 ml BAEE(1 mol·L-1，67 mmol·L-1，pH 7.0 的 PB 配制)中，于37℃水浴孵育6 h后，253 nm測(cè)定吸光度。烙鐵頭粗毒作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6.3 偶氮酪蛋白水解活性 參照文獻(xiàn)［8］的方法。100 μg目標(biāo)蛋白加入1 ml azocasein(5 g·L-1，60 mmol·L-1NaHCO3配制)于37℃水浴孵育6 h后，加入1 ml 1.16 mol·L-1高氯酸終止反應(yīng)，溶液過(guò)濾后于390 nm測(cè)定吸光度。烙鐵頭粗毒作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7 蛋白水解酶抑制作用研究 2.5 μg目標(biāo)蛋白分別與 EDTA(10 mmol·L-1)、1，10-phenanthroline(10 mmol·L-1)、PMSF(10 mmol·L-1)、SBTI(0.5 g·L-1)、EGTA(50 mmol·L-1)于 37℃水浴孵育 1 h，以及與 EGTA(10 mmol·L-1)預(yù)孵 1、2、3 h，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的纖維蛋白原溶液于37℃水浴孵育1 h，12%SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.8 水腫活性檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［9］的方法加以改動(dòng)?！饫ッ鞣N小鼠(體質(zhì)量約18～20 g，n=6)，右、左后足分別注射0.1 μg·g-1目標(biāo)蛋白和等體積PBS緩沖液，1 h后處死，于相同位置剪下左、右后足，稱重后計(jì)算腫脹率/%=［(右足重量-左足重量)/左足重量］×100%。

1.3.9 出血毒活性檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［10］的方法加以改動(dòng)?！饫ッ鞣N小鼠(體質(zhì)量約18～20 g，n=6)背部皮下注射2.5 μg·g-1目標(biāo)蛋白，24 h處死小鼠后剝皮檢測(cè)。烙鐵頭粗毒作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 TMAC-1的分離純化 烙鐵頭蛇毒經(jīng)DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析得到14個(gè)蛋白洗脫峰，其中45～65管和250～260管具有抗補(bǔ)體活性(Fig 1A);收集45～65管活性峰凍干并溶解后上樣至Sephacryl S-100凝膠層析，洗脫峰30～36管和46～56管具有抗補(bǔ)體活性(Fig 1B);收集30～36管活性峰上樣至HiTrap SP HP陽(yáng)離子交換柱，第1個(gè)離子峰具有抗補(bǔ)體活性(Fig 1C)，收集即得目標(biāo)蛋白，命名為T(mén)MAC-1。

Fig 1 The purification of TMAC-1

2.2 理化性質(zhì) 15%SDS-PAGE檢測(cè)表明，TMAC-1在還原條件下分子量約為25 ku，非還原條件下分子量約為24 ku(Fig 2A)。等電聚焦電泳顯示TMAC-1等電點(diǎn)為9.0(Fig 2B)。

Fig 2 Electrophoresis of TMAC-1

2.3 抗補(bǔ)體活性測(cè)定 TMAC-1在預(yù)孵和不預(yù)孵條件下均能抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑和替代途徑的溶血，并呈現(xiàn)劑量依賴性(Fig 3)。在預(yù)孵條件下，對(duì)經(jīng)典途徑和替代途徑溶血的IC50分別為62、29 mg·L-1;不預(yù)孵條件下，其 IC50分別為263、246 mg·L-1。

Fig 3 Inhibitory effect of TMAC-1 on complement hemolysisA and B:Represented the inhibitory effect of TMAC-1 on the classical pathway and the alternative pathway of complement with preincubation or without preincubation，respectively

2.4 補(bǔ)體單一成分C3、C5裂解作用 TMAC-1對(duì)C3、C5有裂解作用(Fig 4)。在還原電泳條件下，經(jīng)5 μg TMAC-1作用4 h后，可見(jiàn)C3的α鏈被降解，β鏈未見(jiàn)明顯降解，而C5的α鏈和β鏈被完全降解。

Fig 4 Digest of C3 and C5 by TMAC-1

2.5 P-selectin測(cè)定 TMAC-1與人血清充分孵育的混合物不能誘導(dǎo)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放P-selectin(Fig 5)。

Fig 5 Effect of TMAC-1 on reducing HMEC to release P-selectinThe difference between(TMAC-1+NHS)and NHS is not significant on statistics

2.6 蛋白水解酶活性及抑制劑對(duì)蛋白水解酶活性的影響

2.6.1 纖維蛋白原水解活性 TMAC-1能夠降解纖維蛋白原(Fig 6A)。10 μg樣品與600 μg纖維蛋白原作用結(jié)果顯示TMAC-1在36 h內(nèi)能夠依次降解纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈、和γ鏈。

2.6.2 抑制劑對(duì)纖維蛋白原水解活性的影響TMAC-1對(duì)纖維蛋白原水解作用能被EDTA(10 mmol·L-1)、1，10-phenanthroline(10 mmol·L-1)、EGTA(50 mmol·L-1)完全抑制，不受 PMSF(10 mmol·L-1)、SBTI(0.5 g·L-1)的抑制(Fig 6B)。

Fig 6 Fibrinogenolytic activity of TMAC-1

2.6.3 其他蛋白水解酶活性 TMAC-1無(wú)BAEE水解活性，具有微弱的偶氮酪蛋白水解活性。

2.7 水腫活性 0.1 μg·g-1TMAC-1誘導(dǎo)的小鼠足跖腫脹率為(36.7±3.7)%，見(jiàn)Fig 7。

Fig 7 Effect of TMAC-1 on inducing edema 1:PBS;2:TMAC-1

2.8 出血毒活性 2.5 μg·g-1TMAC-1注射小鼠皮下，24 h后未發(fā)現(xiàn)出血毒性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析、Sephacryl S-100分子篩、Hitrap SP HP陽(yáng)離子交換層析從湖南產(chǎn)烙鐵頭蛇毒中分離純化出一個(gè)分子量為25 ku、等電點(diǎn)為9.0的抗補(bǔ)體蛋白TMAC-1。該蛋白不具有出血毒活性，具有水腫活性，能夠依次降解纖維蛋白原的Aα、Bβ、γ鏈，該活性能夠被金屬蛋白酶抑制劑完全抑制，不受絲氨酸蛋白酶抑制劑的影響，同時(shí)TMAC-1不具有精氨酸酯酶活性，上述結(jié)果提示TMAC-1是一個(gè)非出血性的金屬蛋白酶。

目前為止，已從各類(lèi)蛇毒中分離純化出很多金屬蛋白酶，根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同將金屬蛋白酶分為4類(lèi):僅含金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的P-Ⅰ型;含有金屬蛋白酶和disintegrin結(jié)構(gòu)域或disintegrin-like結(jié)構(gòu)域的P-Ⅱ型;含有金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、disintegrin-like結(jié)構(gòu)域和富含Cys結(jié)構(gòu)域的P-Ⅲ型;以及包含金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、distintergrin-like結(jié)構(gòu)域、Cys結(jié)構(gòu)域和C-型凝集素結(jié)構(gòu)域的 P-Ⅳ型［11］。P-Ⅰ型金屬蛋白酶分子質(zhì)量約為20～30 ku，根據(jù)分子質(zhì)量我們推測(cè)TMAC-1可能是一個(gè)只含有金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的P-Ⅰ型金屬蛋白酶。

目前已報(bào)道的烙鐵頭蛇毒中有多種活性成分［3-6］，其中從臺(tái)灣產(chǎn)烙鐵頭中分離純化有TM-1、TM-2和 TM-3等金屬蛋白酶［3］，分子質(zhì)量均在24 ku左右，它們能夠裂解纖維蛋白原的Aα和Bβ鏈。本實(shí)驗(yàn)從湖南產(chǎn)烙鐵頭蛇毒中分離純化出的金屬蛋白酶TMAC-1，能夠依次降解Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈，這在金屬蛋白酶中是較為少見(jiàn)的。并且該活性在EGTA終濃度為10 mmol·L-1時(shí)或延長(zhǎng)預(yù)孵時(shí)間至3 h也不能被完全抑制，但當(dāng)EGTA濃度增大后該活性能被完全抑制，但這一現(xiàn)象具體原因還需進(jìn)一步深入研究。

目前已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)作用于補(bǔ)體的蛋白酶，如從Crotalus molossus molossus蛇毒中分離純化出的抑制豚鼠補(bǔ)體的金屬蛋白酶 M5［12］，Naja oxiana眼鏡蛇毒中抑制經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶形成的金屬蛋白酶oxiagin［13］，以及從 Trimeramaturus flavoviridis蛇毒中分離出異源性的 C3/C5轉(zhuǎn)化酶 flavoxobin［14］，它是一種絲氨酸蛋白酶，通過(guò)直接酶切補(bǔ)體C3、C5成分來(lái)激活補(bǔ)體替代途徑并生成活性片段。本工作從湖南產(chǎn)烙鐵頭蛇毒中分離純化出具有抗補(bǔ)體作用的金屬蛋白酶TMAC-1，對(duì)補(bǔ)體的經(jīng)典途徑和替代途徑的溶血均有抑制作用。SDS-PAGE結(jié)果顯示，TMAC-1能夠裂解C3、C5，但與血清孵育產(chǎn)物不能刺激HMEC釋放P-selectin，從而推測(cè)TMAC-1是通過(guò)抑制補(bǔ)體而不是激活補(bǔ)體來(lái)發(fā)揮抗補(bǔ)體作用。又因TMAC-1對(duì)補(bǔ)體替代途徑溶血的抑制作用較對(duì)經(jīng)典途徑的強(qiáng)，故而我們推測(cè)，TMAC-1可能還有其他更重要的靶標(biāo)成分，如替代某些特有的補(bǔ)體成分:B因子、D因子等，從而抑制補(bǔ)體激活，但其確切的抗補(bǔ)體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。

烙鐵頭蛇咬傷一般表現(xiàn)為腫脹、出血、疼痛等，其中的炎癥反應(yīng)主要是由于毒液中的金屬蛋白酶引起的。蛇毒金屬蛋白酶可通過(guò)金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域或去整合素結(jié)構(gòu)域破壞細(xì)胞外基質(zhì)，或者誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放促炎癥因子或黏附分子，從而參與炎癥的發(fā)生發(fā)展［11，15］?？寡a(bǔ)體作用研究顯示 TMAC-1能夠裂解C3、C5，但TMAC-1本身或其酶切補(bǔ)體的產(chǎn)物都不能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放P-selectin，表明其酶切補(bǔ)體并不能產(chǎn)生生理活性片段，這將有利于TMAC-1在抑制補(bǔ)體上的應(yīng)用。而TMAC-1能夠誘導(dǎo)小鼠足跖腫脹，這可能是與其酶切補(bǔ)體成分無(wú)關(guān)，而是由其自身的作用導(dǎo)致的。

本文從烙鐵頭蛇毒中分離純化出一個(gè)具有抗補(bǔ)體活性的金屬蛋白酶TMAC-1，通過(guò)酶切補(bǔ)體特定成分而抑制補(bǔ)體激活。TMAC-1能夠依次降解纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈，能誘導(dǎo)水腫，但不具有出血毒活性。本工作將有助于加深對(duì)烙鐵頭蛇毒蛋白及蛇傷機(jī)制的認(rèn)識(shí)，有助于烙鐵頭蛇傷的治療，但其酶切補(bǔ)體的生物學(xué)意義以及潛在的應(yīng)用價(jià)值，還需進(jìn)一步研究。

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