氧化葡萄糖酸桿菌立體選擇催化2-甲基-1，3-丙二醇合成(R)-β-羥基異丁酸*

魏國(guó)棟，魏東芝，林金萍
(華東理工大學(xué)，魯華生物技術(shù)研究所，生物反應(yīng)器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200237)

β-羥基異丁酸是一種重要的化工醫(yī)藥產(chǎn)品，主要用于合成降壓藥卡托普利和其它的光學(xué)活性物質(zhì)。試驗(yàn)利用氧化葡萄糖酸桿菌不對(duì)稱(chēng)氧化2-甲基-1，3-丙二醇合成了光學(xué)純的(R)-β-羥基異丁酸，研究表明:在28℃和pH值5.5、底物濃度5 g/L、濕細(xì)胞濃度20 g/L的情況下，經(jīng)過(guò)10 h的反應(yīng)，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達(dá)到20.5 g/L，轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到88.6%和95.3%。在培養(yǎng)基中添加一定量(0.1%)的1，2-丙二醇和乙二醇對(duì)菌體生長(zhǎng)、立體選擇性和催化活性都有一定的促進(jìn)作用。通過(guò)流加2-甲基-1，3-丙二醇使其在反應(yīng)體系中的濃度維持在5 g/L以下，以消除過(guò)高的底物濃度對(duì)細(xì)胞活性的抑制，在3.7 L反應(yīng)器中經(jīng)過(guò)24 h的反應(yīng)，(R)-β-羥基異丁酸的濃度提高到50.2 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到90.5%和93.2%。

氧化葡萄糖酸桿菌，生物轉(zhuǎn)化，2-甲基-1，3-丙二醇，(R)-β-羥基異丁酸

氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)是一種專(zhuān)性好氧的革蘭氏陰性菌，屬于醋酸桿菌科，以能夠不完全氧化很多糖醇類(lèi)化合物而著稱(chēng)，而其大多數(shù)參與反應(yīng)的酶位于細(xì)胞膜上，催化反應(yīng)生成的相應(yīng)產(chǎn)物(醛、酮以及有機(jī)酸等)幾乎能夠全部分泌到培養(yǎng)基中，催化反應(yīng)過(guò)程無(wú)需通過(guò)透膜運(yùn)輸，大大提高了其應(yīng)用價(jià)值，相關(guān)研究和應(yīng)用越來(lái)越受到研究人員的重視［1－6］。

光學(xué)活性β-羥基異丁酸，是具有不對(duì)稱(chēng)碳原子的雙功能性物質(zhì)，作為有機(jī)合成的基礎(chǔ)材料，廣泛用于合成多種生理活性物質(zhì)，其合成方法一直是人們研究的熱點(diǎn)。單一構(gòu)型的R型β-羥基異丁酸可以作為有機(jī)合成的手性砌塊參與其它重要手性分子的合成。目前，R型β-羥基酸的制備一般采用化學(xué)拆分的方法，存在副產(chǎn)物如S型β-羥基酸多，后續(xù)分離困難的缺陷，不能滿(mǎn)足有關(guān)領(lǐng)域的需要，而生物轉(zhuǎn)化法具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性。目前已有利用Gluconobacter roseus IAM 1841，Acetobacter sp.和Acetobacter pasteurianus DSM 8937不對(duì)稱(chēng)氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的研究，但是β-羥基異丁酸的得率都比較低。目前，利用微生物氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的研究中，最高的產(chǎn)物濃度也只有 29 g/L［7－10］，因此有必要進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的濃度。本文主要以氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞為生物催化劑，利用其立體選擇性和區(qū)域選擇性的不完全氧化功能，催化2-甲基-1，3-丙二醇生成光學(xué)純(R)-β-羥基異丁酸，確定了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的組成，并對(duì)全細(xì)胞催化過(guò)程進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

氧化葡萄糖桿菌DSM 2003(Gluconobacter oxydans DSM 2003)，由華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器與試劑

恒溫?fù)u床，上海欣鑫自動(dòng)化設(shè)備有限公司;3.7 L發(fā)酵罐，瑞士比歐生物工程公司;高效液相色譜，美國(guó)安捷倫1100 series。

2-甲基-1，3-丙二醇和β-羥基異丁酸甲酯購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司，其余試劑為市售分析純。

1.3 菌體培養(yǎng)

1.3.1 菌體搖瓶培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基配方:山梨醇73.0 g/L，酵母粉18.4 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，KH2PO41.52 g/L，MgSO4·7H2O 0.47 g/L。接種后置于搖床內(nèi)在28℃，250 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 菌體發(fā)酵罐培養(yǎng)

在3.7L發(fā)酵罐中配制2 L培養(yǎng)基。發(fā)酵期間主要控制參數(shù)如下:(1)溶氧。通氣量控制在300 L/h，發(fā)酵罐罐壓控制在0.3～0.6×105Pa，最低攪拌轉(zhuǎn)速控制在400 r/min，當(dāng)發(fā)酵罐溶氧降至30%以下時(shí)，提高轉(zhuǎn)速以增加溶氧，最高轉(zhuǎn)速為1 000 r/min。(2)pH值。自動(dòng)流加2 mol/L的NaOH溶液，保持pH值在6.0左右。(3)溫度。培養(yǎng)過(guò)程中溫度保持在28℃。

1.4 2-甲基-1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)

1.4.1 搖瓶轉(zhuǎn)化

用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配成一定菌體濃度的菌懸液，加入一定量的底物2-甲基-1，3-丙二醇，反應(yīng)體系為10 mL，置于50 mL的三角燒瓶中，于28℃、250 r/min下反應(yīng)。搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行樣，取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值。

1.4.2 3.7 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化

通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓和通氣速率來(lái)控制溶氧在30%以上。間隔0.5～1 h取樣用氣相色譜分析底物濃度，隨時(shí)調(diào)整底物流加速度，使反應(yīng)器內(nèi)的底物濃度控制在5 g/L左右。

1.5 產(chǎn)物的分離純化

轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心除去菌體，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。經(jīng)半制備色譜分離純化得到目標(biāo)產(chǎn)物。

1.6 分析方法

1.6.1 2-甲基-1，3-丙二醇測(cè)定方法的確定

具體色譜條件為:氣相色譜(Agilent 6890)，DBWAX毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器的溫度為280℃。升溫程序?yàn)?100℃保持2 min，然后以20℃/min升溫至180℃，保持1 min，再以30℃/min升溫至220℃，保持5 min。

1.6.2 β-羥基異丁酸測(cè)定方法的確定

液相色譜條件:高效液相色譜(Agilent 1100 series)，ZORBAX SB-Aq 柱，柱溫30℃，進(jìn)樣 5 μL，流動(dòng)相為0.1%的稀磷酸溶液，流速1 mL/min，紫外210 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。進(jìn)樣前，樣品經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.6.3 β-羥基異丁酸對(duì)映體過(guò)量值測(cè)定條件的確定

(R，S)-β-羥基異丁酸甲酯標(biāo)品用HP-chiral 20B手性柱在Agilent 6890氣相色譜儀上進(jìn)行分析。樣品預(yù)處理:1 mL轉(zhuǎn)化液加入2 mL甲醇(含3%H2SO4)，在密閉的條件下于80℃反應(yīng)3 h，生成甲酯后加入2 mL CHCl3萃取，然后用氣相色譜進(jìn)行分析。

色譜條件:氣相色譜(Agilent 6890)，HP-chiral 20B毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度為120℃，檢測(cè)器的溫度為180℃，流速為0.7 mL。升溫程序?yàn)?80℃保持0.2 min，然后以2.5℃/min升溫至85℃，保持0.5 min。然后以1.5℃/min升溫至95℃，保持0.5 min。再以1℃/min升溫至105℃，保持10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞催化2-甲基-1，3-丙二醇的產(chǎn)物生成情況分析

將氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞催化2-甲基-1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行HPLC分析，出現(xiàn)3個(gè)產(chǎn)物峰(圖1)。為了弄清反應(yīng)過(guò)程，優(yōu)化反應(yīng)條件，有必要對(duì)這3個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

圖1 G.oxydans不對(duì)稱(chēng)氧化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸

首先對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。反應(yīng)液經(jīng)離心除去菌體，低溫下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。用半制備色譜(Waters)進(jìn)行分離純化，色譜柱為Atlantis prep dC18OBD(Waters，5 μm，Φ19 mm ×100 mm)，流動(dòng)相為0.1%的磷酸溶液，流速為10 mL/min，上樣量為1 mL，分別收集3個(gè)組分。將3個(gè)組分分別于低溫下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后用半制備色譜分別進(jìn)行2次純化，流動(dòng)相為5%的甲醇溶液。

產(chǎn)物的鑒定。先將2次純化之后收集到的組分直接用GC-MS檢測(cè)，第1組分和第3組分未能檢測(cè)到結(jié)果，而第2組分經(jīng)檢測(cè)為2-甲基丙烯醛，結(jié)果如圖2。

圖2 第2組分的氣質(zhì)聯(lián)用圖譜

通過(guò)對(duì)2-甲基-1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化過(guò)程推斷分析，第1和第3組分很有可能是有機(jī)酸，所以先對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行衍生化，然后用氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分析。根據(jù)圖3和圖4可知，第1組分是目標(biāo)產(chǎn)物β-羥基異丁酸，第3組分是2-甲基丙烯酸。2個(gè)副產(chǎn)物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸可能的形成途徑是:底物2-甲基-1，3-丙二醇在氧化葡萄糖酸桿菌乙醇脫氫酶的作用下首先生成中間產(chǎn)物β-羥基異丁醛，而β-羥基異丁醛在氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞其它酶的作用下發(fā)生脫水反應(yīng)而形成2-甲基丙烯醛，繼續(xù)氧化后生成2-甲基丙烯酸。副產(chǎn)物形成的確切途徑有待于進(jìn)一步研究。

圖3 第1組分衍生物的氣質(zhì)聯(lián)用圖譜

圖4 第3組分衍生物的氣質(zhì)聯(lián)用圖譜

2.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的反應(yīng)過(guò)程

2.2.1 底物濃度對(duì)產(chǎn)物生成和選擇性的影響

由圖5可知，氧化葡萄糖酸桿菌轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇的效率和選擇性對(duì)底物濃度有依賴(lài)性。在底物濃度較低時(shí)，隨著初始底物濃度的增加，反應(yīng)效率也隨之升高，在底物濃度為30 g/L時(shí)產(chǎn)物濃度達(dá)到最高。隨著底物濃度的進(jìn)一步提高，由于底物對(duì)細(xì)胞的活性產(chǎn)生明顯地抑制，催化效率開(kāi)始出現(xiàn)下降。產(chǎn)物的對(duì)映體選擇性(e.e.)隨著底物濃度的增加而降低。綜合轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物光學(xué)純度考慮，確定反應(yīng)體系中的底物濃度為5 g/L。

2.2.2 細(xì)胞濃度對(duì)反應(yīng)的影響

反應(yīng)體系中的菌體量會(huì)直接影響參與反應(yīng)的酶量，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速度以及最終的轉(zhuǎn)化效果。由圖6可知，細(xì)胞濃度對(duì)產(chǎn)物的光學(xué)純度沒(méi)有太大影響。轉(zhuǎn)化效率隨著細(xì)胞濃度的增加而逐漸提高。當(dāng)細(xì)胞濃度超過(guò)20 g/L時(shí)，隨著細(xì)胞濃度的進(jìn)一步提高，轉(zhuǎn)化效率基本不再變化。因此，從高效利用菌體的角度出發(fā)，確定氧化葡萄糖酸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中的細(xì)胞濃度為20 g/L。

圖5 底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率和選擇性的影響

圖6 細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率和選擇性的影響

2.2.3 pH值對(duì)2-甲基-1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

由于酶的構(gòu)型與其離子化狀態(tài)有關(guān)，因此通過(guò)改變pH值可以改變酶反應(yīng)的選擇性。由圖7可知，反應(yīng)體系的pH值為5.5時(shí)，轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物的光學(xué)純度達(dá)到最高，由此確定反應(yīng)的最適pH值為5.5。

圖7 pH對(duì)轉(zhuǎn)化效率和選擇性的影響

2.2.4 溫度對(duì)2-甲基-1，3-丙二醇轉(zhuǎn)化的影響

不同的溫度下，菌體酶的活性不同，反應(yīng)速率會(huì)有所變化，立體選擇性也會(huì)有所不同。在合適的溫度下，酶系能表現(xiàn)最大的活性。由圖8中可知，當(dāng)溫度小于28℃時(shí)，隨著溫度的升高，活化分子增加，酶催化活性提高，轉(zhuǎn)化速率也在提高;而當(dāng)溫度大于28℃時(shí)，隨著溫度升高轉(zhuǎn)化速率開(kāi)始下降，且產(chǎn)物光學(xué)純度也略有下降，因此選擇該轉(zhuǎn)化反應(yīng)最適溫度為28℃。

圖8 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率和選擇性的影響

2.2.5 在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物對(duì)菌體生長(zhǎng)和細(xì)胞催化活性的影響

為了研究菌體培養(yǎng)階段添加醇類(lèi)物質(zhì)對(duì)菌體轉(zhuǎn)化能力的影響，實(shí)驗(yàn)中選取了乙醇、乙二醇、1-丙醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、甘油、1-丁醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇和 2-甲基-1，3-丙二醇等化合物，于接種前添加在培養(yǎng)基中，添加濃度分別為0.1%。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，然后取相同量菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，底物濃度為5 g/L，轉(zhuǎn)化1 h后，用HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)化液中的β-羥基異丁酸濃度。將轉(zhuǎn)化液衍生化后用GC測(cè)定β-羥基異丁酸的光學(xué)純度。結(jié)果如表1所示，在培養(yǎng)基中添加不同誘導(dǎo)物，對(duì)菌體轉(zhuǎn)化活性產(chǎn)生不同程度的影響，對(duì)選擇性的影響不大。在培養(yǎng)基中添加0.1%的1，2-丙二醇和乙二醇，菌體轉(zhuǎn)化活性均有較大提高，但乙二醇對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用;在培養(yǎng)基中添加0.1%的2-甲基-1，3-丙二醇、甘油和2，3-丁二醇，菌體轉(zhuǎn)化活性也有一定幅度提高。

在最優(yōu)搖瓶轉(zhuǎn)化條件下，經(jīng)過(guò)10 h的反應(yīng)，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達(dá)到20.5 g/L，轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到88.6%和95.3%。

2.3 在3.7 L生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇

采用上述最適條件，在3.7 L反應(yīng)器中進(jìn)行氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇的反應(yīng)。為了消除底物對(duì)細(xì)胞活性的抑制，采取流加策略維持反應(yīng)體系中的底物濃度不超過(guò)5 g/L，結(jié)果如圖9所示。在反應(yīng)開(kāi)始后10 h內(nèi)，反應(yīng)非常迅速。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物積累到30 g/L時(shí)，產(chǎn)物抑制效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，反應(yīng)速率下降。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到2 4 h時(shí)，(R)-β-羥基異丁酸的濃度達(dá)到50.2 g/L，轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到90.5%和93.2%。相比于搖瓶中的轉(zhuǎn)化結(jié)果，發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化率和積累的(R)-β-羥基異丁酸濃度都有明顯的提高。同時(shí)對(duì)副產(chǎn)物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸的濃度進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)它們都是很微量的，濃度都小于1 g/L。

表1 添加劑對(duì)氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)、光學(xué)選擇性和催化活性的影響

圖9 在3.7 L發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸

3 結(jié)論

在氧化葡萄糖酸桿菌催化2-甲基-1，3-丙二醇生成(R)-β-羥基異丁酸的過(guò)程中，有副產(chǎn)物2-甲基丙烯醛和2-甲基丙烯酸的生成，但濃度都小于1 g/L。在所考察的影響因素(溫度、pH值、初始底物濃度和細(xì)胞濃度等)中，底物濃度對(duì)產(chǎn)物的合成效率和選擇性的影響最顯著，產(chǎn)物選擇性隨著底物濃度增加而降低，5 g/L的底物就會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制。在菌體培養(yǎng)過(guò)程中，添加0.1%的1，2-丙二醇對(duì)菌體生長(zhǎng)、立體選擇性和催化活性有一定的促進(jìn)作用。最終，在溫度28℃、pH值5.5、細(xì)胞濃度20 g/L、流加底物(≤5 g/L)的情況，3.7L反應(yīng)器中(R)-β-羥基異丁酸的產(chǎn)量達(dá)到50.2 g/L，轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度分別達(dá)到90.5%和93.2%。

［1］ De Ley J，Gillis M，Swings J.The genus Gluconobacter.In:Krieg NR，Holt J G(eds)Bergey＇s manual of systematic bacteriology［M］.Baltimore:Williams and Wilkins，1984:267－278.

［2］ Deppenmeier U，Hoffmeister M，Prust C.Biochemistry and biotechnological applications of Gluconobacter strains［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60:233 －242.

［3］ Prust C，Hoffmeister M，Liesegang H，et al.Complete genome sequence of the acetic bacterium Gluconobacter oxydans［J］.Nat Biotechnol，2005，23:195 －200.

［4］ Matsushita K，Toyama H，Adachi O.Respiratory chains and bioenergetics of acetic acid bacteria ［J］.Adv Microb Physiol，1994，36:247 －301.

［5］ Tkac J，Navratil M，Sturdik E，et al.Monitoring of dihydroxyacetone production during oxidation of glycerol by immobilized Gluconobacter oxydans cells with an enzyme biosensor［J］.Enzyme Microb Technol，2001，28:383 －388.

［6］ Zigova J，Svitel J，Sturdik E.Possibilities of butyric acid production by butanol oxidation with Gluconobacter oxydans coupled with extraction［J］.Chem Biochem Eng Q，2000，14:95－100.

［7］ Ohta H，Tetsukawa H，Noto N.Enantiotopically selective oxidation of α，ω-diols with the enzyme systems of microorganisms［J］.J Org Chem，1982，47:2 400－2 404.

［8］ León R，Prazeres D M F，F(xiàn)ernandes P，et al.A multiphasic hollow fiber reactor for the whole-cell bioconversion of 2-methyl－ 1，3-propanediol to(R)-β-hydroxyisobutyric acid［J］.Biotechnol Prog，2001，17:468 －473.

［9］ León R，Prazeres D M F，Molinari F，et al.Microbial stereoselective oxidation of 2-methyl－1，3-propanediol to(R)-beta-hydroxyisobutyric acid in aqueous/organic biphasic systems［J］.Biocatal.Biotransform，2002，20:201－207.

［10］ Molinari F，Gondolfi R，Villa R，et al.Enantioselective oxidation of prochiral 2-methyl－ 1，3-propanediol by Acetobacter pasteurianus ［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2003，14:2 041－2 043.

Enantioselective Oxidation of 2-methyl-1，3-propanediol to β-hydroxyisobutyric Acid Using Whole Cells of Gluconobacter oxydans DSM 2003

Wei Guo-dong，Wei Dong-zhi，Lin Jin-ping
(State Key Lab of Bioreactor Engineering，New World Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

β-Hydroxyisobutyric acid(β-HIBA)is an important chemical commodity，which is used in the synthesis of Captopril and other optically active compounds.Microbial asymmetric oxidation of 2-methyl-1，3-propandiol using resting cells of Gluconobacter oxydans DSM 2003 was investigated for the synthesis of R-enantiomers of β-HIBA.The results indicated that the concentration of R-β-HIBA reached 20.5 g/L with a molar conversion rate of 88.6%and the optical purity of 95.3%at 10 h under the following conditions:temperature 28℃，pH5.5，substrate concentration 5 g/L and cell concentration 20 g/L.Biamass，stereo-selectivity and cell activity of Gluconobacter oxydans DSM 2003 were improved when 0.1%1，2-propanediol or ethylene glycol was added in the culture medium.Under the optimized reaction conditions in 3.7 L bioreactor，the concentration of R-β-HIBA reached 50.2 g/L with a molar conversion rate of 90.5%and the optical purity of 93.2%at 24 h in a 2-l batch reaction.It was proved efficient and a potential process for the oxidation of 2-methyl-1，3-propanediol to(R)-β-HIBA.

Gluconobacter oxydans，bioconversion，2-methyl-1，3-propandiol，β-hydroxyisobutyric acid

博士(林金萍為通訊作者)。

*國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目基金(No.2009CB724703)和生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(No.2060204)資助

2010－01－19，改回日期:2010－05－25