張哲民,邱德明,李永海

(1.中科院西北高原生物研究所,青海西寧 610001;2.陜西省西安植物園,陜西西安 710061;3.水利部沙棘開發(fā)管理中心,北京 100038)

抑制細(xì)胞生長療法是治療腫瘤的主要方法之一。同時(shí)現(xiàn)有的抗腫瘤藥劑還不是很有效。在使用抑制細(xì)胞生長劑時(shí),常常發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

為了提高抗腫瘤制劑作用的選擇性,試圖利用天然來源的免疫調(diào)制器、抗凝劑、親神經(jīng)劑和膜活性化合物以及利尿素等是眾所周知的。近年來,在綜合化療中使用植物來源的藥劑,引起了研究者的特別興趣。它的特點(diǎn)是生物作用譜廣,毒性小。例如,事實(shí)表明,1964～1965年在H·B·拉扎列夫?qū)嶒?yàn)室已開始研究的剌五加提取物使毒性減弱,并增強(qiáng)了抑制細(xì)胞生長劑的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用。紅景天根提取物、車前汁和黃芩提取物,也顯示出在腫瘤中應(yīng)用的可能性?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)資料證明,利用植物制劑可能具有提高抑制細(xì)胞生長,治療腫瘤的根本效果。它不僅不會增加抑制細(xì)胞生長劑的毒性,而且常常具有實(shí)質(zhì)性降低毒性的作用。大量擴(kuò)大這類植物制劑的使用,必須根據(jù)癌癥過程發(fā)展的特點(diǎn)以及有無伴生病,對癌癥患者進(jìn)行個(gè)別治療。

本研究為了查明沙棘制劑中最有活性而具抗腫瘤作用的制劑類型,并研究其對抑制細(xì)胞生長療法的影響。主要對沙棘制劑進(jìn)行比較研究,以便選出具有顯著抗腫瘤作用又無毒性型的制劑;研究8種沙棘提取物 (油性的和乙醇提取的)對動(dòng)物腫瘤過程發(fā)展的影響;研究沙棘樹皮和樹枝混合提取物抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移影響;研究沙棘樹皮和樹枝混合提取物時(shí)采用環(huán)磷酰胺在抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移中的增效影響。在沙棘制劑比較研究的基礎(chǔ)上,選出了沙棘樹皮和樹枝混合提取物,作為抑制細(xì)胞生長作用最有效選擇性的提取劑。查明了沙棘樹皮和樹枝混合提取物具中等抗腫瘤 (艾氏腎上腺癌,Lewis肺癌,B-16黑素瘤,Pliss淋巴肉瘤)和顯著抗轉(zhuǎn)移效果 (Lewis肺癌,Pliss淋巴肉瘤)。提出沙棘樹皮和樹枝提取物有增強(qiáng)環(huán)磷酰胺抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移的作用 (艾氏腎上腺癌、Lewis肺癌、淋巴肉瘤、W-256肉瘤)。并在腫瘤實(shí)驗(yàn)中選出和研究了有效的新植物制劑,以提高抑制細(xì)胞生長的化療效果。環(huán)磷酰胺與沙棘樹皮和樹枝配合使用,已證明有明顯的抗轉(zhuǎn)移和抗腫瘤療效。

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)在105只移植腫瘤非良種鼠和688只線鼠 (艾氏腎上腺癌、Lewis肺癌,B-16黑素瘤)、173只Vistar系小鼠 (淋巴肉瘤、W-256肉瘤癌)體上完成。實(shí)驗(yàn)中使用法定制劑“沙棘油”(從沙棘果或從沙棘果和葉中制備)、樹皮油性提取物和沙棘根、葉、樹皮、樹枝中的乙醇提取物。制劑來源阿爾泰國立醫(yī)學(xué)院藥型工藝教研室。

用探針把制劑灌入胃中,劑量分別為:

沙棘油——?jiǎng)┝?0.5;1.0;5.0ml/kg;

沙棘樹皮油——?jiǎng)┝?1.0ml/kg;

沙棘樹皮提取物——?jiǎng)┝?.0;5.0ml/kg;

沙棘樹皮提取物脫去50%和100%的生物堿——?jiǎng)┝?.0ml/kg;

沙棘樹皮提取物脫去50%和100%的鞣質(zhì)——?jiǎng)┝?.0和 5.0ml/kg;

沙棘樹枝提取物——?jiǎng)┝?.0ml/kg;

沙棘根提取物——?jiǎng)┝?.0ml/kg;

沙棘葉提取物——?jiǎng)┝?.0ml/kg;

沙棘樹皮和樹枝混合提取物——?jiǎng)┝?.0;5.0;10.0ml/kg(小鼠);

沙棘樹皮和樹枝混合提取物——?jiǎng)┝?.25;0.5;1.0;2.5ml/kg(家鼠)。

為進(jìn)行抑制細(xì)胞生長治療,在抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中使用了環(huán)磷酰胺。

(1)在艾氏腎上腺癌小鼠的實(shí)驗(yàn)中,一次肌肉注射l00mg/kg的細(xì)胞生長抑制劑;(2)在Lewis肺癌小鼠實(shí)驗(yàn)中,兩次肌肉注射100mg/kg(1/4致死量50)制劑,間隔96h,一次肌肉注射125mg/kg(1/2最大耐量)制劑;(3)在W-256肉瘤癌和Pliss淋巴肉瘤的家鼠實(shí)驗(yàn)中,一次腹腔灌服,80mg/kg環(huán)磷酰胺。

療程結(jié)束后,遵照原蘇聯(lián)衛(wèi)生部批準(zhǔn)的 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作守則》規(guī)定,將動(dòng)物斷頭處死,割開動(dòng)物,檢查內(nèi)部器官、淋巴結(jié),分離腫瘤和轉(zhuǎn)移物。

按標(biāo)準(zhǔn)指數(shù),如抑制腫瘤生長百分比、轉(zhuǎn)移率、一組中一個(gè)動(dòng)物轉(zhuǎn)移的平均數(shù)、轉(zhuǎn)移損傷平均面積和淋巴結(jié)總量,對采用治療作用的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移效果進(jìn)行評估。

利用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)法 (Ф-Fisher角變換,υ-Vilkoksona Manna-Uitni)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理;P≤0.05時(shí),差的有效位準(zhǔn)確。

2 結(jié)果和討論

篩選研究結(jié)果查明,從根、樹枝或葉制備的液體提取液,以及沙棘樹皮油性提取物和沙棘果和葉的油制劑,對艾氏腹水癌的生長未顯示出作用。相反沙棘樹皮、樹皮和樹枝混合已醇提取物以及沙棘油制劑,具有抑制小鼠艾氏腎上腺癌生長的效果 (表1)。

表1 沙棘制劑對小鼠艾氏腎上腺癌發(fā)展的作用

在服用沙棘樹皮提取物后,發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)?shù)目拱┬Ч?3%～50%,但伴隨著出現(xiàn)明顯的毒性作用。表現(xiàn)出動(dòng)物死亡 (在某些實(shí)驗(yàn)組中達(dá)50%)。抑制腫瘤生長已查明的提取物的性質(zhì)與Е·Ч·普哈利斯卡婭等人的資料 (1957～1960)提出沙棘樹皮提取物具抗腫瘤效果 (表1)一致。

因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中使用了沙棘樹皮天然提取物,引起動(dòng)物死亡,這是由生物堿 (包括血清毒素)和鞣質(zhì)含量高決定的,所以最好研究全部或部分(50%)脫去這些化合物的沙棘樹皮提取物對動(dòng)物移植腫瘤發(fā)展的影響。在清除天然提取物鞣質(zhì)情況下,抑制腫瘤的生長僅在一種情況下發(fā)生;即給小鼠服用5.0ml/kg的脫去100%上述化合物的沙棘樹皮提取液時(shí),方可觀察到。

在服用天然的并脫去一半鞣質(zhì)的提取物的實(shí)驗(yàn)組中,可以看出死亡動(dòng)物數(shù)增加。

在給動(dòng)物服用脫去50%和100%生物堿的沙棘樹皮提取物時(shí),沒有發(fā)現(xiàn)對艾氏腎上腺癌的生長起作用。研究結(jié)果可以推測,沙棘樹皮天然提取物,在抑制腫瘤生長方面比脫去主要生物活性物的提取物更有效果。由此可見,沙棘樹皮綜合提取物抗腫瘤效果的最終作用,決非屬于生物堿和鞣質(zhì),很可能屬于提取液中它們的復(fù)合體,它們的數(shù)量高低決定著毒性作用 (Е·Ч·普哈利斯卡婭用樹皮中提取的5-羥色胺作抗癌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,從文獻(xiàn)看應(yīng)是確切的)。

考慮到進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的資料,必須選出含有適量主要的生物活性物的最有效和合理的藥型。沙棘樹皮和樹枝按一定比例 (2∶8)混合的這類提取物,是含生物堿0.35%的原料。在保留原料的抗腫瘤活性和充分利用植物原料的情況下,在原料中添加枝條以降低沙棘樹皮提取物已查出的毒性。使用劑量5.0ml/kg這一提取物,確使小鼠艾氏腫瘤的生長有33%受到抑制 (表1)。在抑制艾氏腎上腺癌生長 33%～42%(Pν＜0.05)的某些實(shí)驗(yàn)組中,證實(shí)了劑量減少到1.0ml/kg的沙棘樹皮和樹枝混合提取物,有明顯的抗腫瘤作用 (在無毒性情況下)(上述研究比普哈利斯婭1957～1960年研究沙棘樹皮提取物抑腫瘤抗癌藥性更深入)。

在研究法定制劑沙棘油0.5;1.0;5.0ml/kg對艾氏腎上腺癌發(fā)展的影響中查明,制劑的劑量僅在5.0ml/kg時(shí)表現(xiàn)出抑制腫瘤生長 (41%)的能力。將沙棘樹皮和樹枝混合提取物和沙棘法定制劑有效劑量的實(shí)驗(yàn)研究資料進(jìn)行比較,可以認(rèn)為,對腫瘤發(fā)展的作用是單向性的,但其穩(wěn)定的活性是沙棘樹皮和樹枝混合提取物的優(yōu)點(diǎn)。

在Lewis肺癌的實(shí)驗(yàn)研究中,使用可以確定沙棘制劑對小鼠主要腫瘤結(jié)和轉(zhuǎn)移發(fā)展有影響?？梢哉J(rèn)為,正是用這種腫瘤實(shí)驗(yàn)取得的結(jié)果是最有效的。

在服用植物制劑篩選研究中,表現(xiàn)出最有抗癌效果的沙棘樹皮提取物,在沙棘樹皮和樹枝混合提取物、沙棘油和沙棘樹皮油的條件下,對Lewis肺癌的生長和轉(zhuǎn)移作了研究。

在Lewis肺癌小鼠的實(shí)驗(yàn)中,查明了沙棘樹皮提取物的抗腫瘤作用,但在這一腫瘤模型中同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了毒性作用,有20%的動(dòng)物死亡。在某些實(shí)驗(yàn)組中己證明的沙棘樹皮提取物的毒性性質(zhì)不容許我們進(jìn)一步繼續(xù)研究這一制劑。

另一些結(jié)果是給 Lewis肺癌小鼠服用5.0ml/kg沙棘樹皮和樹枝提取物時(shí)得到的,證明在無毒性條件下對轉(zhuǎn)移過程又有相當(dāng)影響。該提取物其顯著的抗轉(zhuǎn)移作用表現(xiàn)在病灶轉(zhuǎn)移的動(dòng)物數(shù),轉(zhuǎn)移結(jié)數(shù)確實(shí)減少 (減少4.1倍),小鼠肺組織損傷轉(zhuǎn)移面積與對照值相比,減少了1/8(表2)。

應(yīng)當(dāng)指出,沙棘樹皮和樹枝混合提取物的抗轉(zhuǎn)移效果,在一次劑量減少到 l/5時(shí)仍保持藥效。同時(shí)制劑的抗腫瘤效果,在大大降低腫瘤轉(zhuǎn)移率的一個(gè)組中的一只小鼠的轉(zhuǎn)移量確實(shí)減少了(表2)。分析沙棘提取物各種變型影響的研究資料,可以得出結(jié)論:在腫瘤實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究沙棘樹皮和樹枝混合提取物的合理性,作為顯示出穩(wěn)定的抗腫瘤 (艾氏腹水癌),以及明顯抗轉(zhuǎn)移特性 (Lewis肺癌)的最有效藥劑。

在小鼠其它實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤類型中,沙棘樹皮和樹枝提取物顯示出抗腫瘤活性,如對B-16黑素瘤。在腫瘤發(fā)展后期 (從轉(zhuǎn)移后第11晝夜開始)。使用所研究的提取物1.0ml/kg,使原發(fā)性腫瘤結(jié)的重量確實(shí)減少了,而且30%的腫瘤生長受到抑制。而在腫瘤發(fā)展不同階段開始治療B-16黑素瘤時(shí) (移植后第5晝夜),明顯地看到了制劑抗腫瘤的抗轉(zhuǎn)移效果:48%的腫瘤生長受到抑制,抑制轉(zhuǎn)移過程表現(xiàn)在轉(zhuǎn)移率確實(shí)減少,轉(zhuǎn)移面積減少了22.7%。

表2 沙棘樹皮和樹枝提取物對小鼠Lewis肺癌發(fā)展的影響

沙棘樹皮和樹枝混合提取物的抗腫瘤特性,也在另一種動(dòng)物——移植轉(zhuǎn)移腫瘤家鼠 (淋巴肉瘤和W-256肉瘤癌)上進(jìn)行研究。

在研究沙棘樹皮和樹枝提取物對Pliss淋巴肉瘤雄性家鼠影響時(shí),發(fā)現(xiàn)服用0.5ml/kg所研究的提取物的動(dòng)物組中,其抗轉(zhuǎn)移的效果最佳。抑制轉(zhuǎn)移過程表現(xiàn)在轉(zhuǎn)移率從對照組的63%降到實(shí)驗(yàn)組的14%,腫瘤主要轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)重量減少了59%。沙棘樹皮和樹枝混合提取物的抗轉(zhuǎn)移作用,在劑量減少一半的Vistal的雄性家鼠的實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)。同時(shí)應(yīng)該指出,甚至在治療家鼠開始條件下,在移植后的很久期間 (從第11晝夜起)仍然有效果。提取物的抗轉(zhuǎn)移特性表現(xiàn)在腋下淋巴結(jié)重量減少了60%,轉(zhuǎn)移動(dòng)物數(shù)從對照組的80%減少到實(shí)驗(yàn)組的44%。

利用W-256肉瘤癌這類模型的腫瘤在專門移植方法下 (在鼠尾末梢部分皮下注射),可以研究制劑對血原結(jié)和淋巴結(jié)原形成的轉(zhuǎn)移的影響。療程使用劑量為2.5ml/kg的沙棘樹皮和樹枝提取物,甚至在 W-256肉瘤癌發(fā)展的后期(第11晝夜),使主動(dòng)脈淋巴結(jié)的重量減少了71%。值得注意的是,被淋巴原和血原轉(zhuǎn)移而受損傷的家鼠數(shù),比對照組減少了70%。在肉瘤癌W-256的家鼠組中查明了服用劑量減去4/5的沙棘樹皮和樹枝提取物的抗轉(zhuǎn)移特性。沙棘提取物對腫瘤發(fā)展的抑制作用在其療程起作用后,轉(zhuǎn)移率確實(shí)下降。如果在所有動(dòng)物家鼠對照組中發(fā)現(xiàn)組織的轉(zhuǎn)移損傷,那么在服用沙棘樹皮和樹枝混合提取物的實(shí)驗(yàn)組中,只有57%的家鼠發(fā)生轉(zhuǎn)移。

我們主要研究提高抑制細(xì)胞生長劑作用的可能性,它包括在沙棘制劑治療方案中。早先獲得單獨(dú)利用這一制劑治療腫瘤動(dòng)物的肯定結(jié)果,是在采用化療佐以沙棘樹皮和樹枝提取物混合劑的基礎(chǔ)上?？梢酝茰y認(rèn)為,它同抑制細(xì)胞生長劑配合具有同樣效果。

為達(dá)到既定目標(biāo)我們選用了環(huán)磷酰胺,這一細(xì)胞抑制劑的利用常常使腫瘤過程停止發(fā)展,但往往不能排除腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

將沙棘樹皮和樹技混合提取物劑量1.0ml/kg列入用細(xì)胞生長抑制劑治療艾氏腎上腺癌小鼠的方案中,提高了環(huán)磷酰胺的抗腫瘤作用。抑制腫瘤生長為75%,大大超過單獨(dú)使用細(xì)胞生長抑制劑化療的結(jié)果(抑制腫瘤生長49%)(表3)。

證明用沙棘樹皮和樹枝混合提取物提高環(huán)磷酰胺療效的最有價(jià)值的資料,是在治療Lewis肺癌小鼠的實(shí)驗(yàn)中獲得的,綜合治療中投用5.0ml/kg劑量提取物,大大降低轉(zhuǎn)移率和肺部被轉(zhuǎn)移損傷面積。與只用環(huán)磷酰胺治療的動(dòng)物組相比,一只小鼠受損轉(zhuǎn)移數(shù)量減少。證明提高環(huán)磷酰胺抗腫瘤活性的類似結(jié)果,是在使用五倍的低劑量沙棘樹皮和樹枝混合提取物的實(shí)驗(yàn)中得到的。采用綜合治療的方法確實(shí)降低了轉(zhuǎn)移率,同時(shí)使轉(zhuǎn)移面積減少了3.9倍,而一只小鼠的轉(zhuǎn)移面積與服用環(huán)磷酰胺的動(dòng)物組相比,減少了4.2倍。

表3 環(huán)磷酰胺配合使用沙棘樹皮和樹枝提取物對非良種雄小鼠艾氏腎上腺癌生長的影響

在保持抗腫瘤活性條件下,尋找降低環(huán)磷酰胺劑量的途徑是處理降低其毒性的一種方法。因此,與上述以往實(shí)驗(yàn)中使用環(huán)磷酰胺相比,在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用了環(huán)磷酰胺很低的劑量(125mg/kg)。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)指出,在這些條件下(環(huán)磷酰胺抗腫瘤效果弱),在環(huán)磷酰胺背景下佐以植物制劑大大提高了環(huán)磷酰胺作用的選擇性,極大地實(shí)現(xiàn)了抑制腫瘤的擴(kuò)散過程,降低轉(zhuǎn)移率,減少肺組織轉(zhuǎn)移損傷面積,以及一只鼠瘤的轉(zhuǎn)移量 (表4)。環(huán)磷酰胺與沙棘樹皮和樹枝混合提取液的治療作用,在很大程度上抑制腫瘤過程發(fā)展的同時(shí),對動(dòng)物機(jī)體不產(chǎn)生毒性作用 (表4)。

表4 環(huán)磷酰胺配合沙棘樹皮和樹枝提取物對品系F1(ABA/2×C57B1/6)雄性小鼠Lewis肺癌發(fā)展的影響

對艾氏腎上腺癌和Lewis肺癌合用環(huán)磷酰胺與沙棘樹皮和樹枝混合提取物治療具有的良好效果,也在另一類動(dòng)物——Pliss淋巴癌和W-256肉瘤癌家鼠的抗轉(zhuǎn)移腫瘤中得到證實(shí)。

這樣,在移植Pliss淋巴癌家鼠的實(shí)驗(yàn)中,證明了環(huán)磷酰胺在選擇投藥方式對腫瘤的擴(kuò)散過程有刺激作用,相反,用劑量0.25mg/kg的沙棘樹皮和樹枝混合提取物列入抑制細(xì)胞劑的治療方案,使環(huán)磷酰胺的刺激效果變?yōu)橐种菩Ч?使腋下淋巴結(jié)重量和腫瘤轉(zhuǎn)移率減少了1/2(表5)。

表5 環(huán)磷酰胺配合使用沙棘樹皮和樹枝提取物對Vistar品系雄性家鼠Pliss淋巴癌發(fā)展的影響

環(huán)磷酰胺佐以沙棘樹皮和樹枝混合提取物液綜合治療的良好效果,在治療W-256肉瘤癌的家鼠中也能見到。證明用環(huán)磷酰胺和沙棘制劑合用治療家鼠瘤癌,與單獨(dú)使用環(huán)磷組相比(100%),確使腫瘤轉(zhuǎn)移率下降 (33%),使轉(zhuǎn)移的混合型動(dòng)物數(shù) (肺癌和淋巴結(jié)的現(xiàn)有轉(zhuǎn)移動(dòng)物)減少。

根據(jù)以上所述,可以做出結(jié)論:研究結(jié)果表明,沙棘樹皮和樹枝混合提取物可作為綜合治療惡性腫瘤的有效新制劑。沙棘液體提取液在腫瘤實(shí)驗(yàn)中顯示出中等抑制動(dòng)物移植腫瘤的能力極大。抑制腫瘤擴(kuò)散過程的性能,在沙棘樹皮和樹枝提取物和環(huán)磷酰胺合用中,查明了抑制細(xì)胞生長劑在化療中的效果大大提高,同時(shí)觀察到環(huán)磷酰胺對主要腫瘤結(jié)和它抗轉(zhuǎn)移的活性增強(qiáng)。

3 結(jié)論

(1)沙棘制劑在腫瘤實(shí)驗(yàn)中揭示了它是具有明顯抗腫瘤活性的藥劑 (沙棘樹皮提取物,沙棘樹皮和樹枝混合提取物、沙棘油)。發(fā)現(xiàn)沙棘樹皮提取物、沙棘樹皮和樹枝混合提取物具抗轉(zhuǎn)移活性。沙棘樹枝、葉、根提取物、樹皮油、果和葉油對艾氏腹水癌未表現(xiàn)出抗腫瘤特性 (這大概是制劑效應(yīng)對對象物具有選擇性,也即對癥性)。給動(dòng)物服用沙棘樹皮提取物發(fā)現(xiàn)有穩(wěn)定毒性 (與普哈利斯卡婭1957～1960年在實(shí)驗(yàn)研究相比,這也許是前人未發(fā)現(xiàn)的新發(fā)現(xiàn),但普哈利斯卡婭用于實(shí)驗(yàn)的卻是晶狀純提取物5-羥色胺);

(2)篩選研究結(jié)果證明,沙棘樹皮和樹枝混合提取物對艾氏腎上腺癌的生長有很好的抑制性能,療效好,同時(shí)對小鼠機(jī)體產(chǎn)毒性有抑制作用;

(3)沙棘樹皮和樹枝混合提取物具有抑制小鼠Lewis肺癌和B-16黑素瘤轉(zhuǎn)移過程的效果;

(4)沙棘樹皮和樹枝混合提取物在家鼠移植腫瘤Pliss淋巴癌和W-256肉瘤癌方面,表現(xiàn)出抗轉(zhuǎn)移性質(zhì);

(5)沙棘樹皮和樹枝混合提取物可提高環(huán)磷酰胺對艾氏腎上腺癌的抗腫瘤效果;

(6)給Lewis肺癌小鼠合用沙棘樹皮和樹枝混合提取物和環(huán)磷酰胺,使細(xì)胞生長抑制劑的抗腫瘤性能提高,主要是抑制腫瘤擴(kuò)散過程;

(7)給移植腫瘤 (Pliss淋巴癌和W-256肉瘤癌)家鼠服用沙棘樹皮和樹枝混合提取物佐以環(huán)磷酰胺,使細(xì)胞生長抑制劑的抗轉(zhuǎn)移效果提高。