魯長征,山永凱,李樹志,任蓓蕾

(青海清華博眾生物技術(shù)有限公司,青海西寧 810016)

沙棘屬于胡頹子科沙棘屬植物,又名酸刺、醋柳。遍布?xì)W亞大陸的溫帶地區(qū),我國是沙棘資源最豐富的國家,主產(chǎn)于西南、西北等地[1]。研究表明,沙棘的根、莖、葉、花、果中含有糖類、V C、VE、多種氨基酸、亞油酸、黃酮類化合物、磷脂類化合物以及甾醇類化合物等200多種營養(yǎng)物質(zhì),其中具有抗炎抗菌、抗肝炎、抗氧化、降血糖等多種藥理活性的物質(zhì)——熊果酸,由于其獨(dú)特的生物活性和對癌癥的功能作用[2,3],近年來成為沙棘研究的熱點(diǎn),從沙棘果實(shí)加工的殘?jiān)刑崛「呒兌鹊男芄嵩趪鴥?nèi)還未見報(bào)道。青海沙棘因其生長于高原地區(qū),品質(zhì)較內(nèi)地更優(yōu)。為充分利用當(dāng)?shù)刎S富的沙棘資源,本次實(shí)驗(yàn)利用RSM分析法,以提取果汁和沙棘種籽后的沙棘果皮渣為原料,得出提取熊果酸的最佳工藝參數(shù),以期望為熊果酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

沙棘果皮渣 (產(chǎn)于青海)于105℃烘箱中烘干,粉碎,過篩,備用。

1.2 試劑

95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、蒸餾水、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、乙酸等,均為分析純。

1.3 儀器

FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機(jī)、BS323S型分析天平、HS.2型電熱恒溫水浴鍋、PB-10酸度計(jì)、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-3循環(huán)水多用真空泵、DG/20-002臺式干燥箱等。

1.4 方法

1.4.1 提取路線

1.4.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取原料5g,按1∶40加氯仿回流3h脫脂,回收溶劑,殘?jiān)鼡]發(fā)干溶劑,按料液比1∶20加入夾帶劑,按照一定萃取壓力、萃取溫度、CO2流量、原料粒度進(jìn)行超臨界CO2萃取,最后離心得提取液,即為熊果酸粗提液。

1.4.3 熊果酸的測定

1.4.3.1 色譜條件

色譜柱:Luna 5u C18(2),250mm ×4.6mm;Shimpack VP-ODS,150mm×4.6mm,5μm;檢測波長為215nm;流動(dòng)相為0.1mol/L,甲醇∶冰醋酸 (體積比為85∶15);流動(dòng)相流速為0.8ml/min,柱溫為25℃;進(jìn)樣量:20μl;數(shù)據(jù)處理為外標(biāo)法峰面積定量。

1.4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)對照溶液配制

稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品 24.0mg,置于 10ml容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,得含熊果酸2.40mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml,置于5ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,進(jìn)樣20μl,測定峰面積。以峰面積平均值為縱坐標(biāo),其對應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行回歸計(jì)算,得線性方程為:

熊果酸濃度在 35～1120μg/ml,線性關(guān)系良好。

1.4.3.3 樣品溶液的制備

移取 1ml熊果酸提取液,用甲醇定容至25ml,用微孔濾膜 (0.45μm)濾過,精密吸取10μl,按上述色譜條件進(jìn)行測定。重復(fù)進(jìn)樣3次,取均值,根據(jù)回歸方程計(jì)算熊果酸的量。

1.5 試驗(yàn)方案

1.5.1 單因素試驗(yàn)

主要分析夾帶劑、萃取壓力、萃取溫度、CO2流量、原料粒度5個(gè)單因素對熊果酸浸出率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)水平見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)水平

1.5.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken中心組和試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[4,5],采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取因素水平。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2。

2 結(jié)果與分析

表2 試驗(yàn)因素水平

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 夾帶劑對熊果酸浸出率的影響

在進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí),不加夾帶劑時(shí),熊果酸的提取效果很差,通過檢測,沒有或者只有少量熊果酸浸出,因此,必須加入夾帶劑。但夾帶劑的加入量要適當(dāng),如果量太少,起不到作用,但量過多會(huì)改變萃取性質(zhì),使萃取主要在非臨界的液態(tài)下進(jìn)行,這樣往往達(dá)不到理想的萃取效果。由圖1可見,95%乙醇的熊果酸浸出率比其他溶劑高,而且95%乙醇價(jià)格低廉、原料豐富、安全可靠,適合工業(yè)化生產(chǎn),故選擇95%乙醇作夾帶劑,加入量為物料干質(zhì)量的30%。

2.1.2 萃取壓力對熊果酸浸出率的影響

由圖2可以看出,在其它參數(shù)固定的條件下,萃取率隨萃取壓力的升高而增大,在5～20 MPa之間這種增加較為明顯,超過20MPa時(shí),萃取率增大不明顯?？紤]到過高的壓力不僅對設(shè)備和操作提出更高的要求,生產(chǎn)成本也會(huì)相應(yīng)增加,因此綜合考慮萃取壓力選擇20MPa。

2.1.3 萃取溫度對熊果酸浸出率的影響

由圖3可以看出,萃取溫度在25～40℃之間,隨溫度升高熊果酸浸出率增大,但在45℃時(shí),熊果酸浸出率反而下降。這可能是因?yàn)槔^續(xù)升溫時(shí),CO2密度降低,其溶解能力也相應(yīng)降低,使浸出率下降;再者因?yàn)闇囟冗^高會(huì)對熊果酸有一定程度的破壞。故最佳萃取溫度選擇40℃。

2.1.4 CO2流量對熊果酸浸出率的影響

CO2流量是影響浸出率的一個(gè)重要因素。一方面CO2流量增加,超臨界CO2在萃取器中的停留時(shí)間減少,使流體與有效成分接觸時(shí)間減小,萃取平衡受到影響;另一方面,流體流量增加,增加了流體的擾動(dòng),使傳質(zhì)速度加快,有利于萃取速率及萃取率的提高。隨著CO2流量的增大,萃取率也增大。但流量若過大,與物料接觸不夠充分,萃取率會(huì)逐漸趨于緩和,且流量的增大會(huì)增加操作費(fèi)用。綜合考慮,流量選擇20L·h-1為宜。

2.1.5 原料粒度對熊果酸浸出率的影響

由于粒度直接影響到熊果酸提取的操作周期和浸出率。粒度大小直接與總表面積和固相傳質(zhì)系數(shù)有關(guān)。粒度越小,總表面積越大,傳質(zhì)越快,與流體接觸面積越多,浸出率越高。從圖5可知,隨物料粒度變小,浸出率不斷提高,但從20～100目萃取率提高幅度不大,考慮到工業(yè)上粉碎的難度和能耗,綜合分析,選擇最佳粒度為80目。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果

選取萃取壓力、萃取溫度、CO2流量作為自變量,以熊果酸浸出率為響應(yīng)值Y,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。其中1～12是析因試驗(yàn),13～15是中心試驗(yàn),用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差[6]。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 回歸方程及方差分析

熊果酸浸出率 (Y)與萃取壓力 (X1)、萃取溫度 (X2)、CO2流量 (X3)三因素之間的反應(yīng)曲面擬合方程為:

用F值檢驗(yàn)來判定,概率P值越小,其相應(yīng)變量的顯著性越高。從表4中可以看出,方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是顯著的,交互項(xiàng)影響不顯著,故交互項(xiàng)可以省略。因此,各具體試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響并不是簡單的線性關(guān)系。方程復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=90.89%,說明響應(yīng)值的變化有90.89%來源于所選變量,可以用此模型對熊果酸浸出率進(jìn)行分析。在所選的各因素水平范圍內(nèi),按照對結(jié)果的影響排序:X3＞X1＞X2,即:CO2流量＞萃取壓力＞萃取溫度。

表4 回歸方程的方差分析

2.2.3 等高線圖與響應(yīng)面圖分析

比較3組圖可知:CO2流量對熊果酸浸出率的影響最為顯著,其次是萃取壓力,表現(xiàn)為它們的曲線都較陡,而萃取溫度的改變對熊果酸浸出率的影響相對較小,曲線變化較為平滑。

2.2.4 基于實(shí)驗(yàn)編碼值的響應(yīng)值的典型分析結(jié)果

?

穩(wěn)定點(diǎn)的估計(jì)值為：378.9941。

?

從典型分析表6中可以看出，特征值均為負(fù)值,穩(wěn)定點(diǎn)位最大值,即在點(diǎn) (0.50709,0.08177,0.66305)處響應(yīng)值對應(yīng)最大值。所以利用超臨界CO2提取熊果酸的最佳提取條件為:萃取壓力為 22.5MPa,萃取溫度為 40.4℃、CO2流量為23.3L·h-1。在此條件下熊果酸浸出率為:374mg/100g,與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值378.9941非常接近。

3 小結(jié)

實(shí)驗(yàn)證明運(yùn)用RSM方法對沙棘中熊果酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化是非常有效的。通過響應(yīng)面分析法建立各因素與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)模型,可以直觀地看出各因素及各因素之間的作用,進(jìn)而對最佳制備工藝參數(shù)有很大幫助,提高了工作效率。

熊果酸的提取工藝最佳參數(shù)為:萃取壓力為22.5MPa,萃取溫度為 40.4℃、CO2流量為23.3L·h-1。在此條件下熊果酸浸出率為:374mg/100g,與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值378.9941非常接近。

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