范 斌,賀一原,朱道弘,2

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲行為與進化生態(tài)學(xué)實驗室，中國 長沙 410004；2.湖南第一師范學(xué)院，中國 長沙 410205)

栗癭蜂(DryocosmuskuriphilusYasumatsu)屬膜翅目(Hymenoptera)癭蜂科(Cynipidea)栗癭蜂屬，每年發(fā)生1代，主要危害板栗(Castaneamollissima)，也危害茅栗(C.sequinii)和錐栗(C.henryi)．被害枝不能抽發(fā)新梢，嚴重時枯死，不僅影響當(dāng)年生長和結(jié)果，而且影響次年的產(chǎn)量，是危害我國栗樹生長和結(jié)果的主要害蟲之一．該蟲分布于陜西、湖北、湖南、福建等我國大部分板栗產(chǎn)區(qū)，日本、朝鮮等國也有報道[1-3]．

線粒體DNA(mitochondrial DNA， mtDNA)是核外DNA，由于它具有分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，母性遺傳、替換速率相對快及缺少重組等特征，已成為昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)常被選擇的研究對象[4]．對于栗癭蜂而言，因為其特殊的生殖機制(孤雌生殖)，使得栗癭蜂線粒體DNA成為其進化研究中一種有用的分子標記．而16S rRNA基因又是線粒體上進化速率中等的基因，適合于較高分類單元的系統(tǒng)發(fā)育進化的研究．目前，國內(nèi)對栗癭蜂研究主要集中在生活史、發(fā)生規(guī)律和防治策略等方面，而分子水平研究尚未見報道．本研究以栗癭蜂線粒體內(nèi)16S rRNA基因作為分子標記，對福建福州、湖南懷化、山東泰安、河北保定、湖南瀏陽、廣西桂林6個栗癭蜂地理種群的線粒體DNA進行了序列測定和分析，為我國栗癭蜂的分子進化提供理論依據(jù)．

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所用栗癭蜂的蟲癭分別于2005年7月采自福建福州、湖南懷化、山東泰安、河北保定，2009年7月采自湖南瀏陽、廣西桂林．采集的蟲癭于實驗室置于養(yǎng)蟲籠(40 cm×40 cm×20 cm)內(nèi)保存，成蟲羽化當(dāng)日收集的成蟲以無水乙醇浸泡，于-20 ℃的冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 樣品DNA的提取

栗癭蜂1個體置于裝有100 μL STE 緩沖液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)的Eppordef管(1.5 mL)內(nèi)，將其充分搗碎．加質(zhì)量分數(shù)為10%的SDS溶液10 μL，并加2 μL蛋白質(zhì)分解酶K(20 g/L)，以快速混勻器(XL96-B)混勻，置于電熱恒溫水浴鍋(DK-98-1)內(nèi)，37 ℃水浴30 min．加100 μL PCL (苯酚、氯仿、異戊醇體積比為 25∶24∶1)進行抽提，臺式離心機(TG16-WS)離心10 min，轉(zhuǎn)速為5000 r/min(下同)；提取上清液，再加100 μL PCL二次抽提，并二次離心(10 min)．離心后的抽提液加入10 μL NaAc(3 mol/L)和250 μL無水乙醇，-20 ℃過夜．過夜后的樣品以落地式冷凍離心機(J-25)低溫(5 ℃)離心20 min，轉(zhuǎn)速為14 000 r/min(下同)；去上清液，用體積分數(shù)為75 %的冷無水乙醇洗滌后再低溫離心20 min，去上清液并常溫干燥．所得的DNA樣品加50 μL TE 緩沖液，于4 ℃過夜，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 PCR擴增

PCR擴增的上游、下游引物分別為：

5-TRACTGTRCAAAGGTAGC-3；

5-TTAATTCAACATCGAGGTC-3[5](上海生工生物有限公司合成)

PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中10×Buffer(10 mmol/L)5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，上下引物(10 μmol/L)各1 μL，Taq 酶(2.5 mol·min-1·L-1)1 μL，DNA 1 μL，雙蒸水補足50 μL．?dāng)U增條件為96 ℃預(yù)變性3 min，接著進行35個熱循環(huán)：96 ℃變性15 s，49 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)完成后在72 ℃延伸10 min．?dāng)U增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠于0.5×TBE 緩沖液中電泳，電壓70 V，電泳時間約1 h．電泳后以溴化乙錠(EB)染色30 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照．DNA 分子量采用佳和生物科技有限公司的Mark DL2000標記．每次PCR擴增均設(shè)雙蒸水的陰性對照．

1.4 16S rRNA基因序列測定和分析

擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測后，將PCR產(chǎn)物送北京天根生化科技有限公司純化回收，進行雙向測序，以確保序列的可靠性．使用Clustal X 1.81軟件對所得栗癭蜂線粒體16S rRNA基因序列進行排列比對，然后將序列在NCBI中用BLAST進行相似性搜索，確定擴增的片段為目標基因序列．利用Mega 4.0中的雙參數(shù)模型計算各種群的遺傳距離，以落葉松種子小蜂(EurytomalaricisYano)為外群，并用鄰近法(NJ)，最小進化法(ME)，非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMAN)重建系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)進化樹中結(jié)點的自舉檢驗置信度以1 000次自導(dǎo)復(fù)制計算估計．

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

從圖1可見，栗癭蜂16S rRNA的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，大約在430～470 bp之間，為實驗擴增的目的基因范圍，且條帶清晰無雜帶，選取亮而且清晰的條帶純化后測序．

2.2 6個不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因序列比較

經(jīng)Mega4.0軟件分析得出，保定種群、泰安種群、瀏陽種群、福州種群、桂林種群、懷化種群這6個種群的差異非常明顯，堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換和顛換現(xiàn)象嚴重．

2.3 6個不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因序列組成分析

綜合從NCBI檢索獲得的其他栗癭蜂科中枝跗癭蜂(Ibalia)的16S rRNA基因序列進行比對，同源性達80%以上，說明所得序列為栗癭蜂科16S rRNA基因序列．利用Mega 4.0軟件統(tǒng)計出這6個不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因序列間變異位點和A、T、C、G的平均含量．其中，保守位點(C)88個，變異位點(V)270個，簡約信息位點(Pi)155個，自裔位點(Si)15個，分別占24.6%、75.4%、43.3%、32.1%．T、C、A、G堿基平均含量分別為42.6%、8.1%、41.5%、7.8%，其中(A+T)含量(84.1%)明顯高于(C+G)含量(15.9%)．

2.4 6個不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因堿基轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)及遺傳分析

根據(jù)16S rRNA基因序列，通過Mega4.0軟件分析出6個不同地理種群的栗癭蜂的遺傳距離為0.168 4～0.538 7，平均遺傳距離為0.398 0．由表1可以看出桂林和懷化種群間的遺傳距離最小(0.168 4)，親緣關(guān)系最近；瀏陽和桂林種群間的遺傳距離最大(0.538 7)，親緣關(guān)系最遠．整個部分序列中，核苷酸的轉(zhuǎn)換/顛換(TS/TV)平均值為0.4，替換以顛換為主，并且各序列變異位點顛換多于轉(zhuǎn)換(表1)．

表1 目的基因16S rRNA的序列轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)與遺傳距離

注：對角線上三角的數(shù)據(jù)為轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)，對角線下三角的數(shù)據(jù)為遺傳距離.

當(dāng)轉(zhuǎn)換/顛換比值小于2.0時，此基因序列突變達到飽和狀態(tài)，受進化噪音的影響可能性較大[6]．本研究中的6個地理種群的轉(zhuǎn)換/顛換比平均值為0.4，說明栗癭蜂的突變已經(jīng)達到了飽和狀態(tài)，在重建系統(tǒng)樹時受飽和效應(yīng)的影響也越大．為了避免堿基替換飽和分析對系統(tǒng)進化樹分析的影響，本文以遺傳距離為橫坐標，轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)為縱坐標進行散點分析(圖2)．分析結(jié)果顯示，顛換的數(shù)值明顯高于轉(zhuǎn)換的數(shù)值，隨著遺傳距離的增大，顛換數(shù)增加的速度大于轉(zhuǎn)換數(shù)，且轉(zhuǎn)換數(shù)趨于穩(wěn)定，而顛換數(shù)呈直線上升的趨勢．轉(zhuǎn)換和顛換的比率隨著遺傳距離的增加也并未出現(xiàn)飽和狀態(tài)，而是呈穩(wěn)定性的線性增長，因此，在分析中將所有的轉(zhuǎn)換和顛換信息應(yīng)用于系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建．

M:Marker2000；1:保定；2:泰安；3:瀏陽；4:懷化； 5:福州；6:桂林；7:陰性對照圖1 栗癭蜂6地理種群16S rRNA基因的PCR擴增 圖2 栗癭蜂6地理種群堿基替換飽和分析

2.5 6個不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA分子系統(tǒng)進化樹

利用Mega 4.0中的雙參數(shù)模型分析，以落葉松種子小蜂(EurytomalaricisYano)為外群，用鄰近法(NJ法)，最小進化法(ME)，非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMAN)重建系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)進化樹中結(jié)點的自舉檢驗置信度以1 000次重復(fù)估計計算 (圖3～圖5)．

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建不同地理種群的栗癭蜂的NJ樹

圖4 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建不同地理種群的栗癭蜂的ME樹

圖5 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建不同地理種群的栗癭蜂的UPGMAN樹

利用NJ、ME、UPGMAN分析得到的分子系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)基本一致，6個不同地理種群大致可以分為兩個支系，第一個支系由保定、瀏陽、泰安種群組成，并有著極高的置信度(100%)，說明這三者之間具有較近的親緣關(guān)系；第二個支系由福州、桂林、懷化種群組成，前期已經(jīng)出現(xiàn)分化，且置信度相對較低．從總體上看，這6個地理種群在聚類上呈現(xiàn)出一種平行式的分布關(guān)系，并沒有因為地理環(huán)境的遠近而顯示出相應(yīng)的差異性，如空間位置相距較遠的瀏陽和泰安種群并不一定存在大的差異，而較近的懷化和瀏陽種群的差異反而更加顯著．

3 結(jié)論與討論

mtDNA 16S rRNA既具有保守性，又具有高變性．保守性能夠反映出物種的親緣關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索，高變性則能揭示出物種的特征核苷酸序列，是屬種鑒定的分子基礎(chǔ)．目前國內(nèi)外對昆蟲16S rRNA的報道較多，但對栗癭蜂的16S rRNA研究還尚未見報道，而對栗癭蜂的研究又主要集中在對其生物學(xué)特性、發(fā)生和防治等方面，如任淑艷[7]，黃漢杰[8]等；在分子水平上的研究也僅見于賀一原[1-2]和朱道弘[1-2]對栗癭蜂的Wolbachia感染研究．國外對癭蜂科的其他種研究較多，如Dowton M.[9]對枝跗癭蜂(Ibalia)16S rRNA的研究，Buennige M.[10]對食榕小蜂(Sycophila)的研究等．本研究對我國栗癭蜂線粒體DNA 16S rRNA基因序列測定和分析，在一定程度上能為栗癭蜂的系統(tǒng)演化提供分子生物學(xué)方面上的證據(jù)．

對基因序列進行分析，結(jié)果表明，T、C、A、G堿基平均含量分別為42.6%、8.1%、41.5%、7.8%，其中(A+T)含量(84.1%)明顯高于(C+G)含量(15.9%)，表現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏嗜，且A和T堿基含量相當(dāng)，這與Simon[11]等報道的昆蟲線粒體基因的堿基組成特征基本一致．本文所示的6個不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因片段中具有較多的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失現(xiàn)象，這可能是由于16S rRNA基因是一非編碼蛋白基因，在進化中所受到的選擇壓力相對較小的緣故[12]．

盡管建樹方法的設(shè)置參數(shù)不同，但是，這6個不同地理種群的分化趨勢大致相同，即：泰安、保定、瀏陽種群親緣關(guān)系較近，福州、桂林、懷化種群分化程度較高．分化原因可能與栗癭蜂的生活習(xí)性相關(guān)，因栗癭蜂的遷飛能力弱，很難遠距離的轉(zhuǎn)移，在地理隔離的作用下，栗癭蜂由于寄主、氣候等外界環(huán)境因素的影響，向著適應(yīng)自己環(huán)境的方向進化．另一方面，種群突變和遺傳漂變也是導(dǎo)致遺傳距離差異的重要因素．

系統(tǒng)拓撲樹上的有些分支的置信度不是太高，許多低于70，如NJ上的保定種群和瀏陽種群甚至低到49，其原因可能是所研究的序列片段太短(450左右)，不能提供足夠的遺傳信息[13]．另外，整個實驗過程中所選擇的地理種群少，并沒有完全反映出我國栗癭蜂不同地理種群的遺傳分化特征，因此對我國不同地理種群的栗癭蜂遺傳分化還有待進一步探討．

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