彭毛,祁紅林,吳輝,盛立嬌,周建剛,宋功武

(湖北大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖北 武漢 430062)

Scheme 1 EY的分子結(jié)構(gòu)式

曙紅Y(Eosin Y,EY)是一種陰離子型光譜探針,主要以靜電作用力與蛋白質(zhì)結(jié)合[1],已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)[2]、殼聚糖[3]、藥物[4-5]及表面活性劑[6]的檢測,以及與生物大分子作用的機理研究[7]等.生物大分子擁有復(fù)雜的立體構(gòu)象,折疊、螺旋、盤繞等使大分子產(chǎn)生大量的溝壑和空穴,同性電荷相互靠近形成很多微電場谷[8].由于電場的作用,帶有電荷的小分子探針被吸附到微相電場表面.EY分子在溶液中帶有負電荷,與帶正電荷物質(zhì)存在靜電作用.本文中研究了EY與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合作用,計算出了結(jié)合比,結(jié)合常數(shù)等,并進行了試驗條件討論,測定了蛋白質(zhì)的工作曲線.EY的分子結(jié)構(gòu)式,如Scheme 1所示：

1 實驗部分

1.1儀器與試劑UV 2300分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；WH-3微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；TB-85型恒溫水浴槽(Shimadzu)；準確稱取一定量牛血清白蛋白(BSA)(武漢天源生物技術(shù)有限公司,66 000 g/mol),配制成2.12×10-5mol/L的水溶液,置于4 ℃下保存；曙紅Y(EY)(上海試劑三廠),儲備液濃度為1.01×10-3mol/L；試驗用水均為二次去離子水,其他無機鹽試劑未標明的均為分析純.

1.2實驗方法在25 mL 比色管中加入0.2 mL EY 溶液和一定量的BSA 溶液,稀釋至12.5 mL 刻度處,漩渦混勻,放置6 min 后用1 cm 比色皿測其在534、511 nm 處的吸光度,根據(jù)公式(1～7)計算各個參數(shù),并繪制Langmuir等溫吸附曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1基本原理蛋白質(zhì)分子由于復(fù)雜的立體構(gòu)象形成微弱靜電場[9],在其作用下,帶電荷的小分子以單分子層形式被吸附到微相電場表面.由于生化反應(yīng)平衡方程與吸附劑在溶液中對吸附質(zhì)分子的蛋分子層吸附一致,故使用Langmuir 單分子層等溫吸附理論解釋蛋白質(zhì)分子與小分子間相互作用是可行的[10].

Langmuir等溫吸附方程為：

γ-1=N-1+(KNCL)-1

(1)

γ=η×CL0/CS

(2)

CL=(1-η)CL0

(3)

η=(AC-ΔA)/A0

(4)

AC=(ΔA-βΔA′)/(1-αβ)

(5)

η是L的有效反應(yīng)率；CS是蛋白的初始濃度；CL0是染料的初始摩爾濃度.A0、ΔA分別是以水為參比試劑空白、以試劑空白為參比結(jié)合產(chǎn)物在結(jié)合產(chǎn)物最大吸收波長λ2下所測得的吸光度；AC是結(jié)合產(chǎn)物在λ2下經(jīng)光譜修正后的實際吸光度；ΔA′是結(jié)合產(chǎn)物以試劑空白為參比在結(jié)合產(chǎn)物峰谷λ1下測得的吸光度；α、β為光譜校正常數(shù),計算公式分別為：

(6)

(7)

2.2吸收光譜分析EY溶液及其與BSA的反應(yīng)溶液的吸收光譜圖如圖1所示.在400～600 nm 范圍內(nèi),EY在514 nm 處有一最大吸收峰,當加入BSA 后,最大吸收峰紅移至 527 nm 波長處,吸光度值降低.當以試劑空白為參比時,結(jié)合產(chǎn)物的吸收峰和谷吸收分別為 534 nm和511 nm,選此二波長為測定波長λ2、λ1.

圖1 EY及EY-BSA結(jié)合產(chǎn)物的A值EY: 1.62×10-5 mol/L; BSA: 6.86×10-6 mol/L.

圖2 吸光度比值隨VBSA的變化曲線EY: 1.62×10-5 mol/L;BSA: 4.21×10-5 mol/L.

固定EY 的用量,向溶液中加入不同體積的BSA 溶液,以試劑空白為參比,計算其谷與峰處的吸光度比值,如圖2所示.當BSA 加入量(VBSA)大于1.4 mL 時接近最小并基本保持恒定,這表明蛋白用量超過1.4 mL 時溶液中已沒有游離的 EY,據(jù)此可以計算出α=0.634 4.以水為參比,由EY 溶液的吸收光譜中534 nm和511 nm 處的吸光度值,根據(jù)公式(7)計算出β=0.183 5.

2.3反應(yīng)條件的研究

2.3.1 反應(yīng)時間的影響 加入一定量的EY和BSA溶液后,在不同反應(yīng)時間下測其吸收曲線,研究結(jié)合比γ隨時間的變化.結(jié)果顯示,EY與BSA的在室溫下(26 ℃)反應(yīng)速度較快,在6 min 后體系基本達到穩(wěn)定且在半小時內(nèi)都能保持不變,因此選擇溶液放置 6 min 后進行測量.

2.3.2 離子強度的影響 加入不同量1.0 mol/L NaCl 溶液實驗離子強度的影響,反應(yīng)液的離子強度的變化對EY-BSA結(jié)合物的結(jié)合比的影響結(jié)果如圖3所示.從圖中可看出,EY-BSA結(jié)合物的結(jié)合比γ隨離子強度的增加而降低.這是由于Na+、Cl-濃度高時,也能被蛋白質(zhì)中的微電場所吸附,占據(jù)了部分微相表面,從而使EY 的吸附有所減少,結(jié)合比減小.

2.3.3 溫度的影響 在25～52 ℃ 溫度范圍內(nèi)研究了EY-BSA結(jié)合反應(yīng)的吸收隨溫度變化的情況,結(jié)果如圖4所示,可見,結(jié)合比隨溫度的升高而逐漸減小.這是由于溫度升高加快了吸附在蛋白質(zhì)分子上的EY解離,造成溶液中游離態(tài)的EY濃度升高,結(jié)合比下降.這些現(xiàn)象符合固體表面單分子層吸附的一般規(guī)律,支持了生物大分子內(nèi)微靜電場假設(shè).

2.4結(jié)合常數(shù)的測定固定EY的用量,改變BSA(2.12×10-5mol/L)溶液的加入量.分別在30、45和60 ℃下,按實驗方法測定反應(yīng)液在吸收峰(534 nm)和谷(511 nm)處的吸光度值,分別計算AC、η、CL、γ值等,繪制1/γ-1/CL曲線,如圖5所示.

圖3 離子強度對EY-BSA體系的影響B(tài)SA: 3.19×10-6 mol/L; EY: 8.08×10-6 mol/L.

圖4 溫度對EY-BSA結(jié)合比的影響B(tài)SA: 3.19×10-6 mol/L;EY: 8.08×10-6 mol/L.

圖5 EY-BSA體系的1/γ - 1/CL 關(guān)系曲線圖BSA: 3.19×10-6 mol/L.

由圖可見,各曲線均有較好的線性關(guān)系,因此曙紅Y與BSA的結(jié)合符合Langmuir 單分子層吸附,即微相表面吸附.

根據(jù)直線的斜率和截距可分別求得各溫度下結(jié)合物的結(jié)合常數(shù)及最大結(jié)合數(shù),見表1.可見,溫度的升高,EY的結(jié)合常數(shù)降低,這是由于溫度的升高,吸附在蛋白質(zhì)表面上的EY分子的解離加速,從而導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)減小.

表1 EY-BSA體系在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)

2.5蛋白質(zhì)溶液的工作曲線配制系列牛血清白蛋白標準溶液,按實驗方法測量,計算AC值,測定蛋白質(zhì)的工作曲線.結(jié)果表明,蛋白質(zhì)在0～0.20 g/L濃度范圍內(nèi)吸收是線性的：AC=1.494 9C+ 0.010 18(R=0.997 6),該方法的檢出限為 20 mg/L.

2.6金屬離子的干擾在相對誤差為±5%時,分別往一定量的結(jié)合反應(yīng)體系中加入各種金屬離子,對3.19×10-6mol/L BSA溶液測定它們的干擾情況,結(jié)果列入表2中.由結(jié)果可知,這些物質(zhì)的干擾較小,不影響直接測定.

表2 金屬離子干擾情況

3 結(jié)論

本試驗探討了曙紅Y在蛋白質(zhì)上的吸附聚集反應(yīng),由結(jié)果可知,溫度的升高,加快了吸附在BSA上的EY分子的解離,造成溶液本體EY濃度升高,這一現(xiàn)象符合固體表面單分子層吸附的一般規(guī)律.通過Langmiur單分子層等溫吸附理論研究,表明該過程符合Langmuir 等溫吸附,同時也支持了生物大分子內(nèi)微靜電場假設(shè).該方法原理簡單易懂,操作方便,結(jié)果可靠,對研究環(huán)境污染物在生物大分子上的聚集機理與毒性作用等有重要意義.

參考文獻：

[1] 楊昌英,劉義,朱軍成,等.光譜法研究吲哚美辛舒林酸及其金屬配合物與牛血清蛋白的相互作用[J].分析化學(xué),2008,36(4):473-477.

[2] Waheed A A,Gupta P D.Estimation of submicrogram quantities of protein using the dye eosin Y[J].J Biochem Biophys Methods,2000,42(3):125-132.

[3] Du W L,Xu Z R,Han X Y,et al.Preparation,characterization and adsorption properties of chitosan nanoparticles for eosin Y as a model anionic dye[J].J Hazard Mater,2008,15(1-2):152-156.

[4] 趙小輝,牛衛(wèi)芬.曙紅Y共振光散射法測定雙嘧達莫[J].應(yīng)用化學(xué),2008,25(6):693-696.

[5]El-Brashy A M,Metwally M E S,El-Sepai F A.Spectrophotometric determination of some fluoroquinolone antibacterials by binary complex formation with xanthene dyes[J].Il Farmaco,2004,5(10):809-817.

[6] Kovács-Hadady K,Fábián I.The determination of benzalkonium chloride in eye-drops by difference spectrophotometry[J].J Pharm Biomed Anal,1998,16(5):733-740.

[7] Gao D J,Tian Y,Liang F H,et al.Investigation on the pH-dependent binding of Eosin Y and bovine serum albumin by spectral methods[J].J Lumin,2007,127(2):515-522.

[8] Gao H W,Jiang J,Yu L Q.Study on spectrometric probe of protein solution with p-Iodochlorophosphonazo as adsorbate by MPASC technique[J].Analyst,2001,126(4):528-533.

[9] Gao H W,Xu W Q.Langmuir aggregation of Evans blue on cetyltrimethylammonium bromide and on proteins and its application Analytica[J].Chimica Acta,2002,458(2):417-424.

[10] 郜洪文,陳運生.探針體在蛋白質(zhì)大分子上Langmuir吸附聚集及應(yīng)用——蛋白質(zhì)/熒光桃紅B(PB)結(jié)合反應(yīng)研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報,2002,23(5):825-827.

[11] Gao H W.Dual-wavelength spectrophotometric determinations of copper and its composition of the complex with eriochrome blue black R[J].Recl Trav Chim Pays-Bas,1995,114(2):61-64.