陳平 董文杰 孫蘊偉 姚瑋艷 章永平 喬敏敏 袁耀宗

·論著·

PIAS1基因沉默對胰腺腺泡細胞炎癥反應(yīng)的影響

陳平 董文杰 孫蘊偉 姚瑋艷 章永平 喬敏敏 袁耀宗

目的觀察活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子的蛋白抑制因子-1(PIAS1)基因特異性siRNA干擾大鼠胰腺腺泡細胞株AR42J后對雨蛙素誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響，探討其在胰腺炎發(fā)病中的作用。方法采用脂質(zhì)體法將靶向PIAS1的siRNA和陰性siRNA轉(zhuǎn)染AR42J細胞， 24 h后分別加入雨蛙素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同時設(shè)脂質(zhì)體+雨蛙素組、雨蛙素組及僅加PBS的對照組。Western blotting檢測p38絲裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)及磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)表達；RT-PCR及Western blotting檢測各組細胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的mRNA和蛋白表達。結(jié)果siRNA+雨蛙素組、陰性siRNA+雨蛙素組、脂質(zhì)體+雨蛙素組、雨蛙素組及對照組細胞p38MAPK表達量分別為1.93±0.11、1.22±0.10、1.30±0.17、1.32±0.21、0.12±0.02；P-p38MAPK表達量分別為2.10±0.25、1.36±0.20、1.26±0.15、1.23±0.25、0.58±0.48， siRNA+雨蛙素組較其余各組明顯增加(P值均<0.05)。siRNA+雨蛙素組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9 mRNA表達量分別為1.66±0.15、1.66±0.15、1.90±0.01、1.56±0.20；蛋白的表達量分別為2.06±0.37、2.20±0.34、1.80±0.10、1.17±0.05，均較其他雨蛙素處理組表達上調(diào)(P值均<0.05)。結(jié)論PIAS1參與雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺腺泡細胞p38MAPK活性與下游炎癥介質(zhì)的表達調(diào)控。

胰腺； 活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子的蛋白抑制劑-1； 炎癥； 細胞因子

現(xiàn)有研究認為，活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子的蛋白抑制因子-1(protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription 1，PIAS1)通過阻斷轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性、募集轉(zhuǎn)錄的共抑制子或共激活子和促進蛋白SUMO化等機制來調(diào)節(jié)STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄過程[1]，它能阻止免疫調(diào)控基因的產(chǎn)物，以防止失控性炎癥反應(yīng)[2]。大鼠胰腺腺泡細胞株ARJ42細胞具有類似正常胰腺腺泡細胞合成和分泌消化酶樣功能[3]，被廣泛應(yīng)用于胰腺腺泡細胞分泌、生長、增殖、分化、凋亡和炎癥體外模型的研究。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)靜默PIAS1基因，觀察雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J急性胰腺炎體外模型的p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)信號通路變化及其下游調(diào)控的炎癥介質(zhì)的表達，探討PIAS1在急性胰腺炎病程中的作用。

材料和方法

一、siRNA的設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank的PIAS1基因序列(NM_001106829),應(yīng)用Ambion公司網(wǎng)上交互式軟件在線設(shè)計3對siRNA。siRNA-A上游5′-GCAAAU-GGUUAUGAGCCUUTT-3′，下游5′-AAGGCUCAUAACCAUUUGCTT-3′；siRNA-B上游5′-GCUGGA-CGAACUGAUCAAATT-3′，下游5′-UUUGAUCAGUUCGUCCAGCTT-3′；siRNA-C上游5′-CCGGAUCAUUCUAGAGCUUTT-3′，下游5′-AAGCUCUAGAAUGAUCCGGTT-3′。同時,設(shè)計1對陰性對照siRNA,上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。所有siRNA由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

二、有效siRNA篩選

AR42J細胞購自ATCC公司。常規(guī)培養(yǎng)后取對數(shù)生長期細胞，以每孔3×105個細胞接種于6孔培養(yǎng)板。當(dāng)細胞覆蓋達60%～80%時采用脂質(zhì)體(Invitrogen公司)分別轉(zhuǎn)染3對siRNA。Western blotting和RT-PCR篩選最有效siRNA。

三、細胞分組

同上述方法在6孔板中培養(yǎng)細胞達60%～80%融合時，采用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染siRNA(最有效的) 和陰性siRNA，24 h后分別加入雨蛙素(10-8mol)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。同時設(shè)脂質(zhì)體+雨蛙素組、雨蛙素組及僅加PBS的對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。

四、RT-PCR檢測細胞mRNA表達

Trizol試劑(Invitrogen公司)提取各組細胞總RNA，采用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生物工程公司)合成cDNA。目的基因引物序列見表1，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件：94℃ 4 min，94℃ 45 s、56℃(PIAS1和MMP-9)或55℃(GAPDH)或58℃(IL-6、IL-1β)或60℃(TNF-α)45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)攝影，Quantity One軟件灰度分析，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示mRNA的表達量。

五、Western blotting檢測細胞蛋白的表達

采用RIPA分裂液(申能博彩公司)抽提細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，行常規(guī)Western blotting?？筽38MAPK、P-p38MAPK、PIAS1、TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9一抗均購自Santa cruz公司，抗GAPDH抗體購自上?？党晒?，ECL購自Amersham Biosciences公司。最后經(jīng)數(shù)碼成像系統(tǒng)掃描，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值比值作為蛋白表達量。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、最有效靶向PIAS1的siRNA篩選

siRNA-C轉(zhuǎn)染細胞后PIAS1mRNA表達缺如，PIAS1蛋白也最弱(圖1)，故均以siRNA-C進行下一步的所有實驗。

表1 所測目的基因引物序列

圖1 轉(zhuǎn)染細胞PIAS1mRNA(a)和蛋白(b)的表達

二、p38MAPK及P-p38MAPK、TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9蛋白表達的變化

雨蛙素處理后AR42J細胞p38MAPK、P-p38MAPK、TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9蛋白表達均較對照組明顯增加 (P值均<0.05)，其中siRNA+雨蛙素組細胞的表達較其他雨蛙素處理組增加更顯著(P值均<0.05，圖2，表2)。

圖2各組細胞p38MAPK、P-p38MAPK、TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9 蛋白的表達(Western blotting)

三、各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9 mRNA表達的變化

雨蛙素處理AR42J細胞后，TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9 mRNA表達均較對照組明顯增加(P值均<0.05)，其中siRNA+雨蛙素組的表達又較其他雨蛙素處理組增加更明顯(P值均<0.05，圖3，表3)。

表2 各組細胞p38MAPK、P-p38MAPK 、TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9蛋白表達的變化

注：與對照組比較，aP<0.05;與siRNA+雨蛙素組比較，bP<0.05

表3 各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9 mRNA表達的變化

注：與對照組比較，aP<0.05;與siRNA+雨蛙素組比較，bP<0.05

圖3各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9 mRNA的表達(RT-PCR)

討 論

在急性胰腺炎發(fā)病機制研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9等炎癥介質(zhì)參與誘導(dǎo)病程中全身炎癥反應(yīng)綜合征及多臟器功能失調(diào)的發(fā)生，炎癥介質(zhì)過度釋放已成為疾病早期患者病死的原因之一[4]。促炎癥介質(zhì)釋放的信號通路在這過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中p38MAPK參與促進疾病的進展，而應(yīng)用特異性抑制劑可降低急性胰腺炎模型動物死亡率，改善病情[5-6]。我們既往的研究結(jié)果顯示，p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)急性胰腺炎大鼠 TNF-α和IL-1β等炎癥介質(zhì)的釋放，阻斷p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可改善急性胰腺炎病情[7]。本結(jié)果同樣顯示雨蛙素誘導(dǎo)的的AR42J細胞體外炎癥模型，p38MAPK蛋白活性增加， TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9表達增高。

現(xiàn)已證實，PIAS1敲除小鼠經(jīng)脂多糖處理后血清中炎癥介質(zhì)水平增高明顯，發(fā)育遲緩，圍產(chǎn)期死亡增加，因此認為PIAS1敲除小鼠對脂多糖誘導(dǎo)的膿毒血癥具有超敏性[8]。此外，Liu等[9]發(fā)現(xiàn)在TNF-α或脂多糖刺激下，PIAS1中的Ser 90磷酸化，通過SUMO化作用于IκB激酶α，發(fā)揮抑制核因子κB活性，減輕炎癥反應(yīng)。因此，有必要了解PIAS1在急性胰腺炎病程中的作用機制。

本實驗采用RNA干擾技術(shù)沉默AR42J細胞的PIAS1基因表達后，雨蛙素可明顯增加細胞p38MAPK的活性，同時增加TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9等促炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。其原因可能是PIAS1能抑制炎癥介質(zhì)釋放，調(diào)控過度炎癥反應(yīng)；而抑制PIAS1基因的表達，則弱化其對炎癥反應(yīng)的調(diào)控所致。但具體的作用方式仍需要進一步探索。

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2010-02-14)

(本文編輯：屠振興)

EffectofPIAS1genesilencingoninflammatoryresponseofpancreaticacinarcell

CHENPing,DONGWen-jie,SUNYun-wei,YAOWei-yan,ZHANGYong-ping,QIAOMin-min,YUANYao-zong.

DepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

YUANYao-zong,Email:yyz28@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the effect of protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription 1 (PIAS1) gene silencing on the inflammatory response of rat pancreatic acinar cell lines AR42J with cerulein stimulation, to study its role in the pathogenesis of acute pancreatitis.MethodsThe siRNA targeting PIASI was designed, synthesized, transfected into AR42J cells by lipofectmine 2000. 24 h later, cerulean was added and cultured for another 24 h. Subsequent AR42J cells with cerulein stimulation were divided into 4 groups: cerulein, liposome, negative-siRNA and PIAS1-siRNA groups. In addition, a group with PBS was as control group. The activity of p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) was detected by western blotting. TNF-α, IL-1β, IL-6, matrix metalloproteinase (MMP) 9 expression were analyzed by RT-PCR and western blotting, respectively.ResultsThe expression of p38MAPK in PIAS1-siRNA, negative-siRNA, liposome, cerulein,and control group was 1.93±0.11, 1.22±0.10, 1.30±0.17, 1.32±0.21, 0.12±0.02; while the expression of phosphorylated p38MAPK was 2.10±0.25, 1.36±0.20, 1.26±0.15, 1.23±0.25, 0.58±0.48, the expression in PIAS1-siRNA group was significantly increased when compared with other groups (P<0.05). The levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, MMP-9 mRNA were 1.66±0.15,1.66±0.15, 1.90±0.01, 1.56±0.20 in PIAS1-siRNA group, while the expression of protein was 2.06±0.37,2.20±0.34, 1.80±0.10, 1.17±0.05, which was markedly higher than those in other group (P<0.05).ConclusionsPIAS1 gene silencing could enhance p38MAPK activity, and improve inflammatory mediator expression in pancreatic acinar cells with cerulein stimulation.

Pancreas; Protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription 1； Inflammation; Cytokines

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.008

200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科

袁耀宗，Email:yyz28@medmail.com.cn