潘良文 黃一,2 李想 盧鐘山 呂蓉 劉月明 高琴 張舒亞

(1.上海出入境檢驗檢疫局上海200135;2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院)

五種血清型柯薩奇病毒的實時熒光RT-PCR檢測方法研究

潘良文1黃一1,2李想1盧鐘山1呂蓉1劉月明1高琴1張舒亞1

(1.上海出入境檢驗檢疫局上海200135;2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院)

在柯薩奇病毒基因組VP1區(qū)設(shè)計引物和探針,分別建立了特異性檢測5種血清型(A9、A16、B2、B3和B5型)柯薩奇病毒(Coxsackievirus)基于MGB探針的實時熒光RT-PCR方法。通過構(gòu)建的分別適于5種血清型病毒檢測的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子對建立的檢測體系進行了靈敏度分析,確定5種血清型柯薩奇病毒檢測體系的檢測下限均為2拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA。

柯薩奇病毒;實時熒光RT-PCR;質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子;Taqman-MGB探針

1 前言

柯薩奇病毒(Coxsackievirus)屬于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬,據(jù)其生物學(xué)特點分為A組和B組兩類。人類感染柯薩奇病毒后分別引起皰疹性咽峽炎(A組)和非麻痹性類脊髓灰質(zhì)炎(B組)。據(jù)調(diào)查伴有口咽部皰疹和皮疹的急性熱病病例中,79%為柯薩克病毒A組所致,其中較常見的柯薩奇病毒A16型是引起手足口病的主要病原體之一?？滤_奇病毒B組是引發(fā)人類病毒性心肌炎的主要病原微生物[1]。

近年來,在北京、河南、沈陽等地先后發(fā)生多起柯薩奇病毒感染事件[2～4]。2005年5月河南發(fā)生一起柯薩奇病毒B5型疫情,歷時34d發(fā)病49例,14歲以下兒童罹患率達(dá)13.57%[2]。2006年我國衛(wèi)生部門統(tǒng)計,全國各地共報告手足口病達(dá)13637例[4],有相當(dāng)一部分病例是感染A16型柯薩奇病毒所致。目前尚未研制出有效預(yù)防柯薩奇病毒的疫苗,因此加強柯薩奇病毒防控工作尤為重要。為了及時有效地發(fā)現(xiàn)病毒感染源,建立高效的柯薩奇病毒檢測方法是預(yù)防病毒感染和流行的關(guān)鍵技術(shù)手段之一。

國內(nèi)外研究者近幾年相繼報道了柯薩奇病毒的ELISA方法、普通PCR和實時熒光PCR等方法[5～8]。雖然EL ISA方法能檢測早期病人血清中柯薩奇病毒的Ig M和IgG抗體,但該法因抗體制備困難、檢測靈敏度不高使應(yīng)用受到限制?；诤怂岬腜CR檢測技術(shù)成本低且快速,已廣泛應(yīng)用于病毒檢測。前人的研究多基于Taqma-FAM-TAMRA探針,例如Tana(2008)等建立柯薩奇病毒A16型與腸道病毒71型的多重實時熒光PCR方法[5],但是針對單一血清型柯薩奇病毒實時熒光檢測體系的研究相對較少。近來逐漸發(fā)展的Taqman-MGB探針實時熒光PCR技術(shù)具有特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果精確、分辨率高等優(yōu)點,適用于建立針對單一血清型病毒的檢測體系。因此,本研究根據(jù)實驗室已備柯薩奇病毒株(A 9、A 16、B2、B3和B5型),設(shè)計高特異性的引物與M GB探針,建立了分別檢測以上5種血清型柯薩奇病毒的快速、高靈敏度實時熒光RT-PCR方法。

2 材料與方法

2.1 供試病毒

滅活柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型及含GⅡ型諾如病毒糞便樣品均購自中國疾病預(yù)防控制中心病毒預(yù)防控制研究所,血清Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗毒株懸浮液由美國加州大學(xué)學(xué)者惠贈。

2.2 引物與探針設(shè)計

在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別查找柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型cDNA序列,并進行比對和分析,尋找各血清型內(nèi)相對保守,但與其他血清型柯薩奇病毒以及腸道病毒同源性較低的區(qū)域。選擇柯薩奇病毒基因組外殼蛋白VP1編碼區(qū)分別設(shè)計引物和探針CoxA 9-F/R/P、CoxA 16-F/R/P、QCoxB 2-F/R/P、QCoxB 3-F/R/P和QCoxB 5-F/R/P,分別適于柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型的檢測,引物和探針序列信息見表1。

2.3 病毒滅活疫苗、糞便樣品中病毒RNA提取

滅活柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型,含GⅡ型諾如病毒的糞便樣品和血清Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗樣品,使用T IANamp病毒RNA提取試劑盒(天根生物科技<北京>有限公司,Cat.No.:SD 101)進行病毒RNA提取和純化。

2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

采用Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程<大連>有限公司,Cat.No.:DRR037A)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為10μL,包括1×Buffer,0.5 μL RT Enzym e M ix,0.5μLO ligo(dT)(0.125μM),5μL RNA溶液。反應(yīng)條件為:37℃,15 m in;85℃,5s。

2.5 PCR反應(yīng)

2.5.1 普通PCR反應(yīng)

使用普通PCR試劑盒(東洋紡<上海>生物科技有限公司,Cat.No.:BTQ-201)。PCR反應(yīng)體系為25μL,其中包括1×PCR Buffer,1.25 U B lend Taq-PlusDNA聚合酶,0.4μM上游引物,0.4μM下游引物,0.2 mM dNTPs,2μL cDNA溶液。引物EV 1/2[10]反應(yīng)條件為:94℃,2 m in;94℃,30s,60℃,1 m in,72℃,1 m in;45個循環(huán)。引物GⅡ-SKF/R[11]反應(yīng)條件為:94℃,2 m in;94℃,30 s,50℃,30 s,72℃,1 m in;45個循環(huán)。

分別取PCR產(chǎn)物15μL,加1.5μL 10×上樣緩沖液點樣,并加DNA分子量標(biāo)記DL 2000(寶生物工程<大連>有限公司,D 501A)點樣以判斷PCR產(chǎn)物的片段大小。電泳檢測結(jié)果用凝膠分析成像系統(tǒng)記錄。

2.5.2 實時熒光PCR反應(yīng)

使用Prem ix Ex TaqT M試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司,Cat.No.:DRR039A)進行實時熒光PCR反應(yīng),反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)條件為:94℃,10 s;94℃,5 s,60℃,31 s,45個循環(huán)。所有反應(yīng)均重復(fù)3次。以柯薩奇病毒RNA或其cDNA作為陽性對照,以不含有柯薩奇病毒的RNA或cDNA作為陰性對照,以水代替模板作為空白對照。

表2 柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測的反應(yīng)體系

2.6 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建

分別采用引物QCoxA 9-F/R、QCoxA 16-F/R、QCoxB2-F/R、QCoxB3-F/R和QCoxB5-F/R以表1中目標(biāo)血清型病毒cDNA為模板進行普通PCR擴增(如:引物CoxA 9-F/R以柯薩奇病毒A 9型cDNA為模板),目的片段大小分別為91bp、174bp、76bp、80bp和145bp?；厥占兓陨掀?克隆至pMD-18T載體中(寶生物工程<大連>有限公司),經(jīng)酶切和測序鑒定確定陽性克隆。得到分別含有柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B 3和B 5型VP1區(qū)特異性片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-A 9、pMD-A 16、pMD 18-B2、pMD 18-B3和pMD 18-B5。為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,將構(gòu)建的五種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子分別稀釋至106、105、104、103、102、101拷貝/μL,并進一步稀釋至5、1拷貝/μL用于檢測下限分析。

3 結(jié)果

3.1 建立的柯薩奇病毒RT-PCR檢測體系特異性測試

為了測試建立的柯薩奇病毒實時熒光RTPCR檢測體系特異性,以A 9、A 16、B2、B 3和B 5型柯薩奇病毒及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒及GⅡ型諾如病毒cDNA為模板,分別采用引物和探針QCoxA 9-F/R/P、QCoxA 16-F/R/P、QCoxB2-F/R/P、QCoxB 3-F/R/P、QCoxB 5-F/R/P,對以上模板進行實時熒光PCR擴增。結(jié)果表明,柯薩奇病毒A 9型檢測體系只以柯薩奇病毒A 9型cDNA為模板時出現(xiàn)擴增曲線,以其他清型柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒及諾如病毒cDNA為模板時均未見擴增信號;同樣,其他4種血清型柯薩奇病毒RT-PCR檢測體系僅在擴增目標(biāo)血清型病毒cDNA的反應(yīng)中出現(xiàn)熒光幅增,以其他毒cDNA為模板時均未見擴增信號(表3)。為避免假陰性,用腸道病毒檢測引物EV 1/2[10]對柯薩奇病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA樣品進行檢測,均可擴增得到435 bp的目的片段。對GⅡ型諾如病毒cDNA樣品使用引物GⅡ-SKF/R[11]進行擴增,得到344 bp的目的片段(數(shù)據(jù)未在此呈現(xiàn)),表明上述病毒RNA均已成功分離并被反轉(zhuǎn)錄為cDNA,可用于PCR擴增。因此,引物和探針QCoxA 9-F/R/P高度特異于A 9型柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測;引物和探針QCoxA 16-F/R/P、QCoxB2-F/R/P、QCoxB3-F/R/P、QCoxB5-F/R/P也同樣地分別特異于目標(biāo)血清型柯薩奇病毒的檢測。

表3 實時熒光RT-PCR檢測體系的特異性試驗

續(xù)表3

3.2 柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測體系標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD 18-A 9、pMD 18-A 16、pMD 18-B2、pMD 18-B3和pMD 18-B5稀釋至106、105、104、103、102、101拷貝/μL,進行實時熒光PCR反應(yīng),每一梯度模板重復(fù)3次反應(yīng),分別制備A 9、A 16、B2、B3、B5型柯薩奇病毒RT-PCR檢測體系標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),各梯度平均Ct值及其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。

圖1 五種血清型柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測體系的擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1、表4可以看出,5種血清型病毒檢測體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2>0.999)。5種血清型柯薩奇病毒回歸方程斜率分別為-3.33、-3.17、-3.34、-3.33和-3.14,根據(jù)PCR反應(yīng)效率公式(E=10-1/slope-1,slope為斜率)計算,得反應(yīng)效率分別為:99.25%、99.66%、107.97%、99.66%和106.54%,各梯度模板的C t值間隔均勻,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)均低于0.218,可重復(fù)性良好,符合PCR反應(yīng)的動力學(xué)要求。因此,以上結(jié)果表明本研究建立的檢測體系適用于樣品定量分析。

表4 柯薩奇病毒五種血清型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子檢測體系可重復(fù)性測試

3.3 建立的柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測體系靈敏度分析

為了分析建立的檢測體系靈敏度,以5、1拷貝/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD18-A 9為模板,每個濃度各重復(fù)10次,均出現(xiàn)熒光幅增,結(jié)果1拷貝/μL以上質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA濃度模板均檢測到明顯的擴增。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pMD-B 3、pMD-B 5、pMD-A 9和pMD-A 16的10倍梯度稀釋液為模板時,得到相似結(jié)果,即1拷貝/μL以上濃度為模板時均可檢測出明顯的熒光幅增。因此,建立的適于五種血清型柯薩奇病毒檢測的實時熒光RT-PCR檢測體系的檢測下限均可達(dá)到2拷貝(模板量為2μL)。

4 討論

柯薩奇病毒血清型多達(dá)30種,且型與型之間基因組變異度較大,因此設(shè)計適于柯薩奇病毒所有血清型的通用檢測引物非常困難,目前國內(nèi)外相關(guān)的研究報道也較少。為了對柯薩奇病毒實施有效監(jiān)控,建立快速有效的柯薩奇病毒檢測方法至關(guān)重要,根據(jù)柯薩奇病毒各血清型內(nèi)相對保守的特點,本研究針對柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型分別設(shè)計了一套引物和探針。為了保證檢測的高特異性和靈敏度,選擇了Taqm an-MGB探針用于檢測。經(jīng)測試,5套引物和探針QCoxA 9-F/R/P、QCoxA 16-F/R/P、QCoxB2-F/R/P、QCoxB3-F/R/P和QCoxB5-F/R/P均特異于對應(yīng)血清型柯薩奇病毒的檢測。

基于已構(gòu)建的柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子,本研究對5種血清型病毒檢測體系進行靈敏度分析,得到了5種血清型病毒檢測體系靈敏度均為2拷貝質(zhì)粒DNA,制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2>0.999)。Kageyam a T等(2003)[12]建立的諾如病毒實時熒光RT-PCR檢測體系靈敏度為10拷貝質(zhì)粒DNA,標(biāo)準(zhǔn)曲線判定系數(shù)R2=0.995/0.998;潘良文等(2004)[13]對貝類產(chǎn)品中諾如病毒檢測建立的實時熒光RT-PCR體系檢測下限約為6拷貝質(zhì)粒DNA,標(biāo)準(zhǔn)曲線判定系數(shù)R2=0.9944。從以上結(jié)果分析表明本研究建立的檢測體系靈敏度以及標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果與以上報道相當(dāng)。

因此,本研究建立的分別針對柯薩奇病毒A 9、A 16、B2、B3和B5型實時熒光RT-PCR檢測方法具有特異性好和靈敏度高的特點,能夠滿足日常檢驗檢疫的要求。

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Research on Detection of Five Serotypes of Coxsackie Viruses with Real-Time RT-PCR

Pan Liangwen1,Huang Yi1,2,Li Xiang1,Lu Zhongshan1,Lv Rong1,Liu Yueming1,Gao Qin1,Zhang Shuya1
(1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai,200135;2.School of Bioengineering,East China University of Science and Technology)

Based on the VP1 region of Coxsackivirus genome,primer and probe sets have been designed to detect five serotypes of Coxsackieviruses(A9,A16,B2,B3 and B5)separately by real-time RT-PCR.Plas mid standard molecules suitable for coxsackieviruse A9,A16,B2,B3 and B5 detection were constructed respectively.Limits of detection(LODs)of the developed detection systems for five serotypes of Coxsackieviruse were all 2 copies of plasmid standard molecule DNA.

Coxsackievirus;Plasmid Standard Molecule;Rea1-Time RT-PCR;Taqman-MGB Probe

TS245.7

上海技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(07DZ05026);國家質(zhì)檢總局科研項目(2007B150);科技部世博科技專項(2009BAK 43B31);上海市科委創(chuàng)新平臺服務(wù)項目項目(10DZ2294102)