呂 梅， 王瑞輝， 曹基武， 姚利輝， 劉春林

(中南林業(yè)科技大學(xué), 湖南 長沙 410004)

篦子三尖杉愈傷組織的誘導(dǎo)

呂 梅， 王瑞輝， 曹基武， 姚利輝， 劉春林

(中南林業(yè)科技大學(xué), 湖南 長沙 410004)

以篦子三尖杉的幼莖和嫩葉作為外植體進行組織培養(yǎng)，研究不同激素及不同濃度組合對其誘導(dǎo)愈傷組織的影響，結(jié)果表明：篦子三尖杉幼莖比嫩葉的愈傷組織誘導(dǎo)率高；MS+NAA 1mg·L-1+6-BA 0.15mg·L-1+2,4-D 1mg·L-1是誘導(dǎo)幼莖愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達100%；MS培養(yǎng)基相比B5培養(yǎng)基更適合篦子三尖杉嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)；幼莖在75%的酒精中消毒1min，在0.1%的升汞溶液中浸泡15min，其消毒效果最佳。

篦子三尖杉； 組織培養(yǎng)； 愈傷組織； 誘導(dǎo)

篦子三尖杉(CephalotaxusoliveriMast．)別名阿里杉、梳葉圓頭杉，屬三尖杉科，是國家二級保護植物，也是我國特有的比紅豆杉還要古老的一個孑遺物種[1]。篦子三尖杉經(jīng)濟價值較高。 其全株是生產(chǎn)抗白血病藥物三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿的主要原料之一。種子含油率高，可榨油，供制肥皂和潤滑油，加工后也可供食用。木材堅韌，紋理細致，有彈性，可作家具和細木工用材[2]。但是由于其本身的生物、生態(tài)學(xué)特性,加上人類對其生境的破壞以及過度砍伐,使原本自然資源就十分匱乏的篦子三尖杉陷入更加瀕危的境地。目前，隨著篦子三尖杉的開發(fā)利用及其潛在價值的被發(fā)現(xiàn), 篦子三尖杉的快速繁殖顯得越來越重要。但是目前尚未見有關(guān)篦子三尖杉快速繁殖技術(shù)等其它方面的研究報道，人工繁殖技術(shù)體系還不完整。因此我們選用1年生篦子三尖杉幼莖和嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織，為篦子三尖杉的苗木培育，以及種植推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料

篦子三尖杉樣品采自中南林業(yè)科技大學(xué)苗圃，采集時間為2009年6月。樣品為1年生篦子三尖杉幼莖和嫩葉。

1.2實驗設(shè)計

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo) 以MS為基本培養(yǎng)基，采用L9(33)正交試驗設(shè)計(見表1)，對細胞分裂素6 — 芐基嘌呤(6 — BA)、生長素萘乙酸NAA、2, 4- 二氯苯氧乙酸 (2, 4 — D)不同濃度配比方案進行篩選，試驗共9個處理，每個處理共20瓶，5次重復(fù)，每瓶接2個外植體[3-6]。

表1 篦子三尖杉莖尖和嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)的L9(33)正交實驗設(shè)計(mg·L-1)水平NAA的濃度6-BA的濃度2,4-D濃度11.00.10.522.00.151.033.00.22.0

1.2.2 B5培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基對嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo) 分別配置B5與MS培養(yǎng)基,在其中添加細胞分裂素6 — BA 0.2mg·L-1，生長素NAA 3mg·L-1，每處理4瓶，5次重復(fù)，每瓶接3個外植體。

1.3實驗方法

1.3.1 外植體的消毒 剪取生長良好，無病蟲害的篦子三尖杉植株上的幼莖和嫩葉，在流水中沖洗，然后放入稀釋的洗衣粉溶液中清洗，再在流水中逐個沖洗干凈后，于無菌條件下選擇75%的酒精和0.1%的升汞作為消毒劑消毒。莖段在酒精中消毒1min，用無菌水沖洗4～5次，在升汞中消毒分別設(shè)置10min、15min、20min 3個處理。然后用無菌水沖洗7～8次。嫩葉在75%酒精中消毒30～40s，并用無菌水沖洗4～5次，在0.1%的升汞中消毒12min，最后用無菌水沖洗7～8次[7]。

1.3.2 培養(yǎng)條件 采用MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的不同激素，以30g·L-1蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓，按8g·L-1加入瓊脂，調(diào)整pH值至5.8～6.0，于121℃、0.105MPa條件下高溫高壓滅菌20min后置于無菌室待用。將消毒后的莖段切成3～4mm,嫩葉5mm接種于培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃。光培養(yǎng)以日光燈為光源，連續(xù)照光10～12h·d-1，光照度為1000～1500lx。

1.4觀察和統(tǒng)計方法

主要觀察污染、愈傷組織誘導(dǎo)以及褐化情況，其統(tǒng)計方法為：

以出現(xiàn)肉眼可見的愈傷組織記為外植體啟動；

觀察外植體生長狀況及愈傷的顏色與質(zhì)地[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1莖尖消毒效果

藥劑處理的時間不同，外植體滅菌效果的差異則較大, 具體效果見表2。

表2 篦子三尖杉幼莖消毒效果75%酒精消毒時間(min)0.1%升汞消毒時間(min)污染率(%)褐化率(%)生長狀況11075.00正常11510.00正常1207.14.8小部分褐死平均污染率30.7

從表2可以看出，篦子三尖杉嫩莖消毒的平均污染率為30.7%，最大污染率為75.0%，最小污染率為7.1%；升汞消毒10min時,外植體生長正常,但其污染率較高；消毒20min時可以保證低污染率,但會使一些細胞活力喪失甚至死亡；升汞消毒15min基本上可以保證低污染率和外植體正常生長。即75%的酒精消毒1min，0.1%的升汞消毒15min是篦子三尖杉幼莖最佳的消毒方法。

2.2篦子三尖杉幼莖和嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2.1 篦子三尖杉幼莖愈傷組織的誘導(dǎo) 幼莖在接入培養(yǎng)基的第9天開始萌動，與培養(yǎng)基接觸的一端開始膨大，顏色比初始外植體透明，第13天開始長愈傷組織，莖段的一端或兩端長出較小的愈傷顆粒，呈黃色、黃綠色或淡黃色；不同處理的外植體愈傷組織開始萌發(fā)的時間不同，在不同培養(yǎng)基上長出的愈傷組織其大小、顏色、質(zhì)地均有差異；總的來看，愈傷組織的平均體積較小，分化不很完全，顏色均偏黃。從表3可以看出，9個處理平均誘導(dǎo)率為48.2%，最高的是②號處理，其培養(yǎng)基配比為：MS+ NAA 1.0mg·L-1+6-BA 0.15mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率達到100%；最低為⑨號處理，其培養(yǎng)基配比為： MS+NAA 3.0mg·L-1+6-BA 0.2mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率為24.3%。從效果看，②號處理的愈傷組織顏色最好，呈黃綠色，有透明感，質(zhì)地疏軟。良好的愈傷組織必須有高度的胚性和再分化能力，以期可以由這些愈傷組織獲得再生植株，并且要容易分散，有利于分離原生質(zhì)體[9-10]。從本試驗的繼代培養(yǎng)中也可以看出，②號處理誘導(dǎo)出的愈傷組織具有粘性，可以進一步分化，其他處理誘導(dǎo)的愈傷組織顏色逐漸變成枯黃或褐色甚至停止生長。

表3 篦子三尖杉幼莖愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計表編號植物激素濃度組合(mg·L-1)莖愈傷組織的誘導(dǎo)效果NAA6—BA2,4—D顏色質(zhì)地誘導(dǎo)率(%)①1.00.10.5黃綠色疏軟87.5②1.00.151.0黃綠色疏軟100③1.00.22.0黃色緊密26.7④2.00.11.0黃色緊密46.7⑤2.00.152.0淡黃色緊密48.6⑥2.00.20.5黃色緊密26.3⑦3.00.12.0黃色致密25.0⑧3.00.150.5淡黃色致密48.7⑨3.00.21.0淡黃色致密24.3 注:平均誘導(dǎo)率48.2%;最高誘導(dǎo)率100%;最低誘導(dǎo)率24.3%。

2.2.2 篦子三尖杉嫩葉愈傷組織誘導(dǎo) 將消毒后的嫩葉接種于配置好的培養(yǎng)基內(nèi)，至第6天時，葉片顏色透明，有的彎曲成拱形，第12天開始有愈傷組織長出，在葉片表面有愈傷組織顆粒突出。但愈傷組織生長緩慢，兩個月后，葉片表面仍有小愈傷顆粒突起。

從表4中可以看出，嫩葉愈傷組織平均誘導(dǎo)率為23.7%，最高誘導(dǎo)率為⑦號處理，其培養(yǎng)基配比為； MS+ NAA 3.0mg·L-1+6 — BA 0.1mg·L-1+2，4 — D 2.0mg·L-1，誘導(dǎo)率為48.6%；最低誘導(dǎo)率為⑨號處理，其培養(yǎng)基配比為： MS+ NAA 3.0mg·L-1+6— BA 0.2mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1，誘導(dǎo)率為2.8%。可見，6 — BA的濃度太高不利于嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)。鄒露、曹福祥等人在篦子三尖杉嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)實驗中也發(fā)現(xiàn)，6 — BA對愈傷組織誘導(dǎo)影響作用較大，其次是2，4 — D，但兩者濃度過高對愈傷組織誘導(dǎo)不利[6]。對比幼莖愈傷組織誘導(dǎo)，嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)率較低，平均比幼莖愈傷組織誘導(dǎo)率低24.5%，且誘導(dǎo)出的愈傷組織生長緩慢，在繼代培養(yǎng)中進一步分化困難。

表4 篦子三尖杉嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計表編號植物激素濃度組合(mg·L-1)嫩葉誘導(dǎo)的愈傷效果NAA6—BA2,4—D顏色質(zhì)地誘導(dǎo)率(%)①1.00.10.5黃色疏散12.5②1.00.151.0淡黃色疏散36.1③1.00.22.0黃色緊密6.7④2.00.11.0淡黃色疏散27.0⑤2.00.152.0黃色緊密39.4⑥2.00.20.5黃色緊密5.2⑦3.00.12.0淡綠色緊密48.6⑧3.00.150.5淡黃色緊密35.3⑨3.00.21.0黃色緊密2.8 注:平均誘導(dǎo)率23.7%;最高誘導(dǎo)率48.6%;最低誘導(dǎo)率2.8%。

2.3不同培養(yǎng)基對篦子三尖杉嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)效果

接種在MS培養(yǎng)基內(nèi)的嫩葉，第7天開始彎曲變形，有得成拱形，第13天時葉的表面長出不均勻的愈傷顆粒，B5培養(yǎng)基的主要特點是含有較低的銨，實驗發(fā)現(xiàn)在B5培養(yǎng)基內(nèi)的嫩葉，顏色變成深綠色，沒有愈傷組織生成。表明B5培養(yǎng)基不適宜篦子三尖杉愈傷組織的誘導(dǎo)。

表5 B5與MS培養(yǎng)基對嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)效果培養(yǎng)基配方接種外植體數(shù)(個)愈傷組織數(shù)(個)愈傷組織誘導(dǎo)率(%)B5+6—BA0.2mg·L-1+NAA3mg·L-16000MS+6—BA0.2mg·L-1+NAAmg·L-1603361.1

3 結(jié)論與討論

最適宜篦子三尖杉幼莖消毒的方法是75%酒精消毒1min,0.1%的升汞消毒15min；篦子三尖杉的幼莖比嫩葉的愈傷組織誘導(dǎo)率要高。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方是MS+NAA 1mg·L-1+6 — BA 0.15mg·L-1+2,4 — D 1mg·L-1，誘導(dǎo)率為100%；且誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色黃綠，質(zhì)地疏軟，適合于以后的分化培養(yǎng)；但是，在此配方培養(yǎng)基上，愈傷開始生長的時間偏長，且生長緩慢，有待于進一步探討其他更好的誘導(dǎo)方法。實驗還發(fā)現(xiàn)，B5培養(yǎng)基不適合篦子三尖杉嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)。

[1] 傅立國.中國珍稀瀕危保護植物[M].上海:上海教育出版社,1989.

[2] 胡玉熹.三尖杉生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1999:3-5,95-118.

[3] 曹孜義.實用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州:甘肅科學(xué)技術(shù)出版社,2001.

[4] 李浚明.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2001.

[5] 梁一池.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進展[J].福建林學(xué)院學(xué)報,2002,22 (1) :93-96.

[6] 鄒露.篦子三尖杉愈傷組織的研究[M].經(jīng)濟林研究，2009,27(2):74-77.

[7] 符文英,杜道林,符木均.海南粗榧愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40(1):36-38.

[8] 洪偉.林業(yè)試驗設(shè)計技術(shù)與方法[M].北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社,1993:148- 158.

[9] 洪偉,吳承禎.試驗設(shè)計與分析[M].北京:中國林業(yè)出版社,2004:49.

[10] 姜新兵.香榧離體再生系統(tǒng)建立的研究[D].杭州:浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,2004.

(責(zé)任編輯：唐效蓉)

(英文編譯：張 珉)

CallusinductionofCephalotaxusoliveri

Lü Mei, WANG Ruihui, CAO Jiwu, YAO Lihui, LIU Chunlin

(Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

Taken young leaves and stem segments ofCephalotaxusoliverias explants, the effects of different hormone and proportions on callus induction ofCephalotaxusoliveriwere researched. The results indicated the induction rate of young stem callus were higher than that of young leaves callus. The best medium for inducing young stem callus was MS+NAA 1mg·L-1+6-BA 0.15mg·L-1+2,4-D 1mg·L-1and the induction rate reached 100%. MS medium was more suitable for inducing young leaves callus than B5 medium. The best sterilization procedure for young stem was to soak stem for 1min in 75% alcohol and 15min in 0.1% HgCl2.

Cephalotaxusoliveri; tissue culture; callus; induction

2009 — 11 — 06

2009 — 12 — 31

國家林業(yè)局項目“珍稀瀕危樹種篦子三尖杉資源調(diào)查及利用狀況評估”(2008-353)

S 722.3+7

A

1003 — 5710(2010)01 — 0007 — 03